《Microorganisms》：The Taxonomic Diversity of Prokaryotic Communities from Permafrost Active Layers of the Chilean Andes
Viktória Faragó,
Andrea K. Borsodi and
Balázs Nagy
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本文通过Illumina 16S rRNA基因测序，揭示了智利安第斯山脉极端环境中多年冻土活动层的微生物多样性。研究表明，水分可用性是塑造群落结构的关键，细菌多样性高于古菌，且优势菌门分布与生境干湿条件密切相关。本研究为理解极端环境微生物生态及其对气候变化的响应提供了新见解。
引言
据估计，全球约11%的陆地表面受多年冻土影响。多年冻土是至少连续两年温度保持在0°C或以下的土层。其上层1-2米被称为活动层，经历冻融循环。由于全球变暖，活动层在许多地区增厚，导致微生物活性增加，并释放出如甲烷和二氧化碳等温室气体。智利拥有多样的极端环境，包括地球上最干旱的阿塔卡马沙漠，以及巴塔哥尼亚的冰原、冷湖和冰川。本研究旨在深入了解智利安第斯山脉不同气候区（干旱与湿润）此前几乎未受干扰的多年冻土区域的微生物分类多样性，并揭示先前未知的古菌群落多样性。我们假设，尽管样品均采集自两个采样点的多年冻土活动层，但由于地理纬度和气候条件的差异，微生物群落组成会存在不同，且采样深度会影响微生物群落结构。
材料与方法
采样点描述
一个采样区位于智利北部的“干旱安第斯”山脉，另一个位于智利巴塔哥尼亚地区。在干旱安第斯山脉内选择了两个地点采集样品：位于奥霍斯-德尔萨拉多火山地区的阿塔卡马营地（海拔5260米）和特霍斯营地（海拔5830米）。巴塔哥尼亚的样品则采集自托雷斯德尔潘恩国家公园内的加德纳山口地区（海拔1180米），并选取佩霍埃湖湖畔（海拔40米）作为对照采样点。所有样品均采集自活动层（季节性融化的土层）。
采样过程、土壤化学分析
奥霍斯-德尔萨拉多样品于2024年1月底采集，托雷斯德尔潘恩样品于2024年3月初采集。样品采集了多个深度（10, 35, 60厘米）。使用Vario MAX cube CNS分析仪测定土壤总碳、氮、硫浓度。
环境DNA提取与16S rRNA扩增子测序
使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒提取环境DNA。采用针对16S rRNA基因V3–V4可变区的细菌特异性引物和古菌特异性引物进行PCR扩增，由SEQME公司进行Illumina测序。
数据分析与统计
使用R语言中的DADA2和phyloseq软件包处理序列数据。Alpha多样性指数通过重抽样至最小测序深度（细菌n = 12,646）进行计算。Beta多样性基于Bray–Curtis相似性矩阵，并利用非度量多维标度法（NMDS）进行可视化。使用PERMANOVA检验群落组成的差异。在目水平上使用MaAsLin2进行差异丰度分析。
结果与讨论
微生物群落在观测到的多样性方面以细菌类群为主，古菌类群的多样性较低。
细菌的Alpha多样性
尽管环境条件恶劣，但在活动层中观察到了高水平的细菌多样性。加德纳山口样品的细菌Alpha多样性最高。与假设相反，对照样品的多样性并未高于其他样品。尽管湿润和干旱地区的Alpha多样性指数相似，但湿润土壤显示出更高的扩增子序列变体（ASVs）数量，这可能表明较高的水分条件与群落中存在低丰度类群或栖息地特化种有关。
细菌的Beta多样性
NMDS分析（应力值=0.0458）显示，四个采样点各自形成独立的组，来自同一区域的样品位置相近。PERMANOVA结果表明，采样点（对照、加德纳山口、阿塔卡马或特霍斯）和区域（托雷斯德尔潘恩或奥霍斯-德尔萨拉多）与细菌群落组成的差异相关。采样点解释了Bray–Curtis相似性方差的较大比例（R2= 0.3819），高于采样区域（R2= 0.1678），这表明地点特异性条件可能在塑造细菌群落结构方面比更广泛的地理差异作用更强。采样深度与细菌群落组成的可检测差异无关。
细菌类群的相对丰度
共鉴定出42个细菌门，其中最丰富的是放线菌门（Actinomycetota，37.84%）、假单胞菌门（Pseudomonadota，14.84%）、酸杆菌门（Acidobacteriota，11.51%）、绿弯菌门（Chloroflexota，10.23%）和拟杆菌门（Bacteroidota，10.12%）。基于Bray–Curtis距离的树状图将奥霍斯-德尔萨拉多和巴塔哥尼亚样品分为两组。
除了永久冻土的存在，水分可用性是塑造微生物群落的关键环境因素。本研究检测了安第斯山脉干旱地区的样品，这些样品以放线菌门（Actinomycetota）为主，该门以其高抗旱性为特征。在奥霍斯-德尔萨拉多样品中，放线菌门中最丰富的目是丙酸杆菌目（Propionibacteriales）和土壤红杆菌目（Solirubrobacterales），其中丙酸杆菌目几乎全部属于诺卡氏菌科（Nocardioidaceae，99.8%），且94.69%被归类为类诺卡氏菌属（Nocardioides）。类诺卡氏菌属能耐受各种寡营养条件，甚至能够降解多种难以降解的污染物。土壤红杆菌目，特别是土壤红杆菌属（Solirubrobacter），也以高丰度存在于所有奥霍斯-德尔萨拉多样品中。
绿弯菌门在加德纳山口样品中丰度较高，占这四个样品细菌群落的22.82%至34.27%。先前研究发现，多年冻土中绿弯菌门的丰度与相对较低的养分有效性和较高的水分含量有关。同样，拟杆菌门与年平均降水量呈显著正相关，其在巴塔哥尼亚寡营养湖岸采集的对照样品中丰度最高。
我们的研究结果表明，光合营养类群没有出现，或者出现极少。尽管在奥霍斯-德尔萨拉多样品中分析的样品显示出表明干旱的门的存在，这对蓝细菌不利，因为蓝细菌需要较高的水活度（范围从1到0.6）。托雷斯德尔潘恩的环境条件并不妨碍蓝细菌的出现，但未能检测到。可能这些类群的存在受到其他类群的抑制，或者它们可能出现在比10厘米更接近地表的位置。然而，本研究中的所有样品均从至少10厘米的深度采集，那里的光照穿透可能不足以支持光合作用。
差异丰度分析确定了与采样点显著相关的多个细菌目。土地杆菌目（Terriglobales）和固氮杆菌目（Solibacterales）在阿塔卡马和特霍斯营地耗竭，而亚硝化球菌目（Nitrosococcales）和热微菌目（Thermomicrobiales）在这些地点富集。弗兰克氏菌目（Frankiales）成员在奥霍斯-德尔萨拉多的极端地点更丰富，而伯克氏菌目（Burkholderiales）主要与加德纳山口样品相关，表明群落组成沿着环境梯度发生了转变。
古菌的多样性
与对照样品相比，奥霍斯-德尔萨拉多和来自山区的托雷斯德尔潘恩样品的古菌模式显示出差异。古菌的NMDS分析和PERMANOVA分析显示出与细菌结果相似的模式。采样深度的影响小于对细菌的影响，而采样地点和采样区域与古菌群落组成的差异相关。
古菌的差异丰度分析表明，泉古菌门（Thermoproteota，先前称为奇古菌门Thaumarchaeota）的成员，特别是硝化球菌目（Nitrososphaerales），在多年冻土相关采样点富集，而亚硝化球菌目（Nitrosotaleales）在加德纳山口最为丰富。这些目被称为氨氧化古菌（AOA）。它们是自养的，能够从无机CO2中固定自身的碳。氨氧化菌被视为特化微生物，因为它们通常依赖氨作为唯一的还原力来源。虽然氨氧化细菌（AOB）如亚硝化球菌目（Nitrosococcales）也存在于这些环境中，但氨氧化古菌（AOA）的主导地位表明，这些样品中的硝化作用主要由古菌驱动。之前的一项研究发现，氨氧化细菌（AOB）仅在高氨浓度下生长，而氨氧化古菌（AOA）则偏好低、中、高氨浓度。本研究中分析的样品被定性为寡营养，表明存在的是氨氧化古菌（AOA）而非氨氧化细菌（AOB）。
我们的研究表明，光合营养或厌氧类群在细菌和古菌中没有出现，或者仅以可忽略的程度出现。厌氧微生物的缺失也不明显，不同全球多年冻土环境中可能有10-15%的厌氧微生物存活。这很可能是由于所分析的活动层质地粗糙，且强风限制了厌氧菌的存在。群落组成表明存在化能无机营养代谢策略，这在碳限制环境中具有优势，因为无机电子供体和碳源比有机底物更持续可用。
结论
对智利安第斯山脉不同气候区（干旱和湿润）中这些基本未开发的多年冻土区域的原核生物分类多样性进行比较，揭示了这些环境栖息着多样且独特的微生物群落，其特征是细菌的代表性高于古菌。细菌群落的结构可能与多年冻土活动层的水分活度有关。湿润的巴塔哥尼亚样品显示出更高的生物多样性，绿弯菌门和拟杆菌门丰度较大，而极度干旱的奥霍斯-德尔萨拉多样品则以放线菌门为主，这与极端干旱胁迫相一致。古菌群落多样性较低，但表现出强烈的功能特化。氨氧化类群的高丰度表明，在这些极端环境中，硝化作用主要由古菌驱动。这些发现支持了我们最初的假设，即地理和气候差异塑造了微生物群落组成。然而，与我们的预期相反，采样深度对群落结构没有可检测到的影响。在该数据集中，深度相关效应的缺失表明，与地点特异性的环境差异相比，垂直变化相对较弱。
