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本研究成功构建了一种针对柑橘类病毒V (CVd-V) 的TaqMan探针法RT-qPCR检测技术。该方法具有高灵敏度（检测限低至1.123个拷贝）、高特异性（与其他柑橘类病毒无交叉反应）的特点。通过比对常规终点RT-PCR及评估快速粗提（PDCE）与总RNA提取两种样本处理方式，证明该RT-qPCR在田间监测中更具优势。在意大利西西里岛柑橘产区的调查首次揭示了CVd-V的流行情况（总体检出率8.1%），为柑橘产业中此类病毒的监测与防控提供了高效、可靠的工具。
引言
柑橘属（Citrus）植物是全球最重要的经济林木之一。地中海地区的柑橘产业尤为发达，其产量占全球总产的20%以上。意大利是欧洲第二大柑橘生产国，其种植区主要集中在西西里岛。柑橘主要通过嫁接进行无性繁殖，选择合适的砧木-接穗组合对于确保高产、抗逆和抗病至关重要。历史上，酸橙（Citrus aurantiumL.）是地中海盆地的主要砧木，但由于其对柑橘衰退病病毒（CTV）高度敏感，其使用受到限制。这促使人们转而使用对CTV耐受的替代砧木，例如来自枳（Poncirus trifoliataL.）的杂交种，但这些砧木对类病毒等病害的敏感性有所增加。
类病毒是一种微小的单链环状RNA分子（246–401 nt），不编码任何蛋白质，完全依赖宿主完成复制。目前已发现八种类病毒可感染柑橘植物，其中柑橘类病毒V (CVd-V) 属于Apscaviroid epsiloncitri种，是起源最不确定的类病毒之一。CVd-V通过受感染的繁殖材料传播，已在多个大洲的国家有报道，并首次在意大利被检测到。虽然CVd-V通常被认为无症状，但在香橼（Etrog citron）上已观察到叶部和茎秆症状。当CVd-V与其他类病毒（如CDVd或CBLVd）混合感染时，会产生协同效应，导致更严重的症状。由于商业柑橘树常感染多种类病毒，且受感染的繁殖材料可能多年无症状，因此防止CVd-V传播严重依赖于分子诊断来筛选繁殖材料，确保其无类病毒状态。
尽管意大利其他地区（如拉齐奥、托斯卡纳和坎帕尼亚）已对类病毒流行情况进行评估，但作为意大利柑橘主产区的西西里岛尚未进行过相关调查。因此，本研究旨在开发一种灵敏、特异的探针法RT-qPCR用于CVd-V检测，并评估其在西西里岛柑橘园中的发生情况。
材料与方法
RT-qPCR引物与探针设计
针对CVd-V基因组的一个保守105 bp区域，设计了一对特异性引物（CVd-VF273, CVd-VR68）和一个TaqMan探针（CVd-VP18）。探针5'端标记FAM报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团。通过BLASTn、Oligo Analyzer工具及Vector NTI软件进行in silico分析，确认所设计的引物和探针不与柑橘其他已知类病毒及非靶标生物发生交叉反应或形成二级结构、发夹。
RT-qPCR条件
反应体系总体积20 μL，包含3 μL总RNA、0.5 μM正反向引物、0.25 μM TaqMan探针、1× CAPITAL? 1-Step qRT-PCR Probe预混液、1 μL反转录酶（含RNase抑制剂）。在Rotor-Gene Q2plex HRM平台仪上运行，反应程序为：50°C反转录10分钟，95°C酶失活10分钟，随后进行45个循环的95°C 15秒和60°C 60秒。每个循环结束时检测荧光。所有实验均设置三个技术重复。
RT-qPCR特异性验证
使用已知仅感染CVd-V或其他七种柑橘类病毒（HSVd, CEVd, CDVd, CBLVd, CBCVd, CVd-VI, CVd-VII）之一的柑橘样品总RNA提取物，验证RT-qPCR的特异性。同时设置健康柑橘样品阴性对照和无模板对照。
标准质粒制备与灵敏度分析
将CVd-V全基因组克隆至pGEM-T载体，构建标准质粒pCVD-V#01。通过公式计算质粒拷贝数。为评估检测限（LoD）并生成标准曲线，将质粒进行10倍系列稀释（从40 ng/μL至40 × 10?10ng/μL），取1 μL进行RT-qPCR。以Ct值为纵坐标，质粒拷贝数对数为横坐标绘制标准曲线，并根据曲线斜率计算扩增效率。
RT-qPCR与常规PCR灵敏度比较
使用上述质粒系列稀释液，比较所开发的RT-qPCR与常规终点PCR的检测灵敏度。终点PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
植物材料收集与核酸提取
于2025年春季，从西西里岛主要柑橘产区（卡塔尼亚、墨西拿、锡拉库萨省）的商业果园以及一个保存有古老品种的种质资源库中，共收集111份无症状柑橘植株样本（每株10片叶）。
采用两种方法制备检测模板：
- 1.
总RNA提取：使用商业试剂盒提取总RNA，浓度调整至约50 ng/μL。
- 2.
叶柄圆片粗提物 (Petiole-Disc Crude Extract, PDCE) 制备：一种快速、低成本的方法，将新鲜切取的叶柄印记在带正电荷的杂交膜上，用甘氨酸缓冲液洗脱后，取上清液作为模板。
田间样本检测与灵敏度评估
使用所开发的RT-qPCR方法，分别以总RNA和PDCE为模板，对111份样本进行CVd-V检测。同时，使用基于总RNA的两步法终点RT-PCR对相同样本进行检测，以比较两种方法在实际植物样本中的性能。
结果
RT-qPCR特异性与灵敏度
特异性测试显示，所开发的RT-qPCR仅能检测CVd-V阳性样本，而对其他七种柑橘类病毒感染的样本及阴性对照均无交叉反应，表明其特异性良好。
灵敏度分析表明，RT-qPCR可稳定检测到低至40 × 10?10ng/μL（约1.123个拷贝）的质粒稀释度。标准曲线显示良好的线性关系，相关系数R2= 0.9996。相比之下，常规终点PCR仅能可靠检测到40 × 10?9ng/μL（约112.3个拷贝）的稀释度。因此，RT-qPCR的检测灵敏度比终点PCR高约10倍。
田间样本检测结果
对111份样本的检测结果显示：
- •
RT-qPCR（总RNA模板）共检出9份CVd-V阳性样本，总体发病率为8.1%。
- •
其中，来自种质资源库的31份样本中有4份阳性（12.9%），来自商业果园的80份样本中有5份阳性（6.25%）。
- •
所有阳性样本在使用PDCE粗提物为模板的RT-qPCR中也呈阳性，但Ct值较高。
- •
终点RT-PCR未能检出部分在RT-qPCR中呈阳性的样本，进一步证实了RT-qPCR具有更高的检测灵敏度。
- •
所有受感染的植株均为嫁接到枳橙或酸橙砧木上的甜橙新品种（除一株为嫁接到枳橙砧木上的柠檬），且均未表现症状，证实不同柑橘寄主可无症状携带CVd-V。
讨论
随着对CTV敏感的传统砧木（如酸橙）被限制使用，转为使用对CTV耐受但可能对类病毒更敏感的替代砧木，地中海盆地柑橘园面临的类病毒侵染风险增加。CVd-V等类病毒通过受感染的繁殖材料传播，且常与其他类病毒混合感染产生协同效应，加剧危害。由于缺乏灵敏、快速的诊断工具，其实际流行情况常被低估。
本研究开发的CVd-V特异性RT-qPCR检测方法，在灵敏度（检测限约1.123拷贝）、特异性方面表现优异，优于已报道的基于SYBR Green的多重RT-qPCR或使用通用引物的检测方法，为CVd-V的监测提供了更可靠的工具。
首次在西西里岛进行的调查揭示了CVd-V在该地区的存在（总体发病率8.1%），感染了包括塔罗科和桑吉内洛血橙在内的品种。考虑到这些古老品种的选育历史，CVd-V可能早已存在，但受限于早期诊断技术而未被发现。本研究中观察到的发病率与其他国家的部分报道（如中国4.7%，土耳其25%）相近，但低于某些地区（如巴基斯坦高达93%），表明CVd-V的实际分布可能比已知的更广泛。
结论
本研究成功建立了一种高灵敏度、高特异性的TaqMan探针法RT-qPCR，用于柑橘类病毒V (CVd-V) 的检测。该方法在灵敏度和特异性上均优于常规终点RT-PCR。评估显示，快速的PDCE粗提方法与总RNA提取结合该RT-qPCR，可用于田间直接检测，大大节约了成本和时间，为柑橘果园的例行监测和无病毒繁殖材料认证提供了高效工具。对西西里岛的调查首次报告了CVd-V在该地区的发生，强调了在意大利及更广泛的柑橘产区开展更全面调查的必要性。
