《Viruses》：Honey Bee Viromes from Beekeeping Operations Experiencing High Losses in 2022–2023
Boone H. Jones,
Taylor Reams,
Lauren Jonas,
Brandon K. Hopkins and
Michelle L. Flenniken
编辑推荐：
本文通过宏基因组学测序技术，深入研究了2022-2023年美国加州四个高损失商业化养蜂场的蜜蜂（Apis mellifera）病毒组，旨在揭示蜂群数量衰退与病毒的潜在关联。研究发现，高损失蜂群中病毒（尤其是新发现的三种小双节RNA病毒样序列AmPVLC-1、AmPVLC-2、AmPVLR-1）丰度显著更高。这项研究不仅更新了我们对蜜蜂病毒多样性的认知，也为理解蜂群损失综合征（Colony Collapse Disorder, CCD）的病原学机制提供了新的关键线索。
引言：蜜蜂蜂群损失与病毒组研究背景
近年来，蜜蜂（Apis mellifera）蜂群的高年损失率已成为全球关注的焦点。在美国，2008年至2025年间，蜂群年损失率平均高达40%，这对养蜂人、种植者、政策制定者和科学家构成了严峻挑战。病毒是蜜蜂病原体中最丰富的一类，影响蜜蜂健康并导致蜂群损失。本研究聚焦于2022-2023年养蜂季节期间，对经历了蜂群数量衰退（平均约44%）的商业化管理蜂群进行纵向监测，旨在通过宏基因组学测序探究其病毒组，验证新病毒或病毒基因组变异可能与这些衰退相关的假说。
材料与方法：样本采集与病毒组学分析流程
本研究样本来源于美国加州四个不同的商业化养蜂场（A-D）。在2022年8月/9月、11月及2023年1月等多个时间点，对蜂群进行重复评估和采样。监测内容包括蜂群数量（以蜜蜂覆盖的巢脾数作为健康指标）和瓦螨（Varroa destructor）侵染水平评估。蜂群根据种群动态分为“高损失”、“健康”、“死亡”和“衰退/恢复”四类；根据瓦螨压力分为“高”、“低”和“后高”三类。
为进行病毒分析，来自同一分类标准的蜂群样本被汇池。每个蜂群样本随机选取10只成年蜜蜂，经匀浆、离心后获得裂解液。为富集病毒核酸，裂解液用核酸酶（Benzonase和RNAse 1）处理，以降解未包裹的DNA和RNA，然后使用TRIzol试剂提取RNA。提取的RNA（1 μg）被用于制备测序文库，并在Illumina Novaseq X Plus平台上进行双端测序，每个文库平均产生约8百万条reads。
生物信息学分析流程严谨。首先，使用FastQC和BBDuk对原始测序数据进行质量评估和接头修剪。然后，将reads比对到参考蜜蜂基因组（Amel_HAv3.1）和蜜蜂相关微生物索引（HoloBee index），去除比对上的宿主和非病毒序列，以富集病毒序列。之后，对未比对上的reads进行从头组装（使用SPAdes），生成重叠群。将这些重叠群去冗余（使用CD-HIT，聚类阈值95%核苷酸同一性，保留长度>1000 nt的序列）后，通过DIAMOND比对NCBI病毒RefSeq蛋白数据库和基于隐马尔可夫模型的VOG数据库搜索，鉴定出具有病毒同源性的重叠群。最后，将每个文库的测序reads重新比对到鉴定出的病毒重叠群，计算其丰度（归一化为每千碱基每百万片段数，FPKM），并进行统计分析。
结果
1. 蜂群样本特征与高损失背景
监测的四个加州养蜂场在2022年秋季至2023年1月期间，蜂群数量平均下降39%，其中C、D两场的损失尤为显著（44.1%和51.1%）。在监测期间，蜂群死亡比例在不同蜂场间存在差异（A场18%，B场26.4%等）。本研究共对38个测序文库（代表141个蜂群样本）进行了分析，以探究病毒与蜂群衰退的关联。
2. 测序数据概况与病毒读段富集
测序平均每个文库产生约8.05百万条reads。经过滤和比对，平均约59.74%的reads比对到蜜蜂基因组，约1.56%比对到非病毒微生物索引。对剩余的reads进行从头组装和病毒鉴定，最终得到一份包含64个非冗余重叠群的列表，其中包含16种已明确的蜜蜂/瓦螨病毒、8种植物病毒和26个未描述的病毒或病毒样序列。比对分析显示，代表“死亡”和“高损失”蜂群的文库中，比对到病毒的reads比例（分别为44%和24%）显著高于“健康”（16%）和“衰退/恢复”（8%）的蜂群文库。
3. 已明确病毒的遗传相似性与新变异株的发现
本研究对包括急性蜜蜂麻痹病毒、畸形翅病毒A/B型、黑蜂王台病毒、萨克布罗病毒等在内的16种已明确的蜜蜂/瓦螨病毒进行了测序。这些病毒在不同蜂场间序列高度相似（核苷酸同一性>97%），表明它们代表了加州地区流行的主要病毒株系。同时，研究发现了两种重要的新病毒变异株：
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急性蜜蜂麻痹病毒加州2022变异株：在经历高损失的C蜂场和蒙大拿州的一个蜂场中丰度较高，表明其可能地理分布广泛。
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赛奈湖病毒9型：是C蜂场2022年9月样本中最丰富的病毒，但在该蜂场后续采样中未检测到，表明其存在可能具有时间特异性。
4. 新型、高丰度的小双节RNA病毒样序列的鉴定
本研究最突出的发现之一是鉴定出三种先前未描述的小双节RNA病毒样序列，它们在所有四个蜂场中均普遍存在且丰度极高：
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蜜蜂相关小双节RNA病毒样衣壳1：长度1399 nt，推测编码衣壳蛋白。
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蜜蜂相关小双节RNA病毒样衣壳2：长度1472 nt，推测编码衣壳蛋白。
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蜜蜂相关小双节RNA病毒样RNA依赖的RNA聚合酶1：长度1398 nt，推测编码RdRp。
此外，两种先前已有描述但特征不明确的小双节RNA病毒样序列——湖北小双节RNA病毒样病毒34和蜜蜂相关小双节RNA病毒样病毒1——也在所有蜂场样本中高丰度存在。相关性分析显示，AmPVLC-1、AmPVLC-2和HPLV-34的丰度在文库水平和蜂群水平均显著正相关，表明这三者可能构成同一个多分体小双节RNA病毒基因组的三个不同片段。
5. 病毒丰度与蜂群健康状态的关联
总体病毒丰度，特别是小双节RNA病毒样序列的丰度，在代表“死亡”蜂群的文库中最高，其次是“高损失”蜂群。统计检验表明，代表“死亡”蜂群的文库其总病毒丰度显著高于“健康”和“衰退/恢复”的蜂群。同样，其小双节RNA病毒样序列丰度也显著高于“衰退/恢复”的蜂群。代表“死亡”和“高损失”蜂群的文库中，小双节RNA病毒样序列分别占总病毒读段的69%和67%，显著高于“健康”蜂群（58%）和“衰退/恢复”蜂群（<1%）。
6. 瓦螨侵染与病毒丰度
分析显示，来自“高”瓦螨压力和“后高”瓦螨压力蜂群的文库，其畸形翅病毒A型和B型的丰度，均显著高于来自“低”瓦螨压力蜂群的文库。这再次证实了瓦螨作为畸形翅病毒复制能力载体在病毒传播和增殖中的关键作用，并表明即使在螨害得到控制后，病毒水平仍可能维持高位。
7. 平均数据的局限性
研究指出，基于分类（如“高损失”）的平均病毒组成和丰度，并不能代表该类中所有单个文库的情况。例如，少数高病毒载量的文库主导了“高损失”类别的平均结果。因此，在解释基于平均数据的病毒-健康关联时需要谨慎，因为这可能无法反映个体蜂群的异质性。
讨论与结论
本研究利用病毒组学方法，揭示了2022-2023年加州高损失商业化蜂场中丰富的病毒多样性。最关键的发现是鉴定出三种新型、高丰度、广泛存在的小双节RNA病毒样序列，以及两种已知但未充分表征的类似序列。这些序列，特别是AmPVLC-2，与已知的能导致宿主雄性不育的昆虫病毒存在较远的同源性。尽管尚未在蜜蜂中证实其复制能力，但其高丰度和普遍性强烈提示它们可能代表了一个或多个能在蜜蜂中复制的小双节RNA病毒基因组片段。丰度相关性分析进一步支持AmPVLC-1、AmPVLC-2和HPLV-34可能属于同一个多分体病毒。
研究数据明确显示，总病毒丰度，尤其是小双节RNA病毒样序列的丰度，在监测期间死亡或经历高损失的蜂群中显著更高。这为病毒（包括这些新发现的病毒样因子）在蜂群健康恶化中可能扮演的角色提供了强有力的关联证据。然而，由于本研究的观察性质，这种关联并不等同于因果关系。这些病毒可能通过消耗宿主资源或引发免疫反应，即使在未引起明显症状的情况下，也对个体蜜蜂或整个蜂群的健康产生负面影响。
此外，研究还发现了新的赛奈湖病毒9型和急性蜜蜂麻痹病毒变异株，并再次确认了瓦螨侵染与畸形翅病毒高载量之间的紧密联系。研究也警示，基于分类平均值得出的结论可能受少数极端值文库的影响，未必能准确反映组内所有个体的实际情况。
综上所述，本研究极大地扩展了对蜜蜂病毒组，特别是小双节RNA病毒样序列多样性的认知。研究结果表明，病毒，尤其是新发现的这些高丰度病毒样因子，与蜂群的高损失率显著相关。这强调了在蜂群健康管理中考虑病毒因素的极端重要性，并为未来深入研究特定病毒及其毒株对蜜蜂个体和群体健康的影响，以及评估其潜在的致病机制，奠定了坚实的基础，指明了新的方向。
