荔枝TIFY基因家族的全基因组分析：鉴定、鉴定与果皮着色调控关键成员的表达谱

《Biology》：Genome-Wide Analysis of the TIFY Gene Family in Litchi (Litchi chinensis Sonn.): Identification and Expression Profiling Yuhu Tang, Xing Meng, Peidong Chen, Dong Yu, Tangxiu Li and Wuqiang Ma

本文对荔枝TIFY基因家族进行了首次系统性鉴定，鉴定出14个LcTIFY基因，并通过生物信息学分析与表达谱验证，发现LcPPD1、LcJAZ5和LcJAZ7基因的表达与“妃子笑”荔枝果皮花青素积累显著相关，为解析荔枝果实着色分子机制提供了新线索。

　　

荔枝TIFY基因家族的全基因组分析：鉴定、鉴定与果皮着色调控关键成员的表达谱

1. 引言

荔枝因其甜美的口感和诱人的红色果皮而备受珍视，但“妃子笑”等优良品种在采收时常常因着色不完全而影响其商品价值。果皮着色，特别是花青素的积累，是决定荔枝外观吸引力和市场价值的关键性状。TIFY是一类植物特有的、具有多效功能的新型转录因子家族，在众多植物物种中已被广泛研究，已知其成员参与植物生长、发育、激素信号转导以及果实着色（如花青素生物合成）等多种生物学过程。例如，在拟南芥中，JAZ蛋白通过调控WD-重复/bHLH/MYB转录复合物来调控茉莉酸介导的花青素合成。在苹果中，MdJAZ2蛋白被证明通过与MdHIR蛋白互作，负调控花青素合成和果实着色。然而，TIFY基因家族在荔枝中的存在及其功能尚属未知。为了揭示其在荔枝，特别是“妃子笑”品种果皮着色过程中的潜在作用，本研究基于已发布的染色体级别的荔枝基因组，首次对荔枝TIFY基因家族进行了全基因组范围的系统性鉴定和综合分析。

2. 材料与方法

研究从Sapindaceae基因组数据库中获取荔枝基因组序列。首先，通过BLASTP比对和基于TIFY保守结构域（PF06200）的隐马尔可夫模型（HMM）搜索相结合的方法，从荔枝蛋白序列中鉴定出候选TIFY基因。利用多种生物信息学工具分析了其理化性质、亚细胞定位、系统发育关系、保守基序与结构域、基因结构、miRNA靶位点、启动子顺式作用元件、蛋白质二级与三维结构、染色体分布、基因复制事件和共线性关系。表达分析方面，结合了“妃子笑”品种不同组织的公开RNA测序（RNA-Seq）数据，以及通过外源脱落酸（ABA，促着色）和氯吡脲（CPPU，抑制着色）处理调控果皮着色过程的转录组数据和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证数据，以探究LcTIFY基因的表达模式及其与果皮着色相关生理指标（如花青素含量、可溶性固形物SSC、可滴定酸TA）的关联。

3. 结果

3.1. 荔枝中TIFY基因的鉴定

本研究在荔枝中共鉴定出14个TIFY基因，命名为LcTIFY1-14。根据其蛋白序列特征，这些基因被划分为四个亚家族：包含1个成员的TIFY亚家族、2个成员的PPD亚家族、3个成员的ZML亚家族以及8个成员的JAZ亚家族。所有LcTIFY蛋白均预测定位于细胞核，这与它们作为转录因子的功能相符。其氨基酸长度、分子量和等电点等理化性质存在一定差异。

3.2. LcTIFY蛋白的系统发育关系

基于荔枝和拟南芥TIFY蛋白序列构建的系统发育树显示，14个LcTIFY蛋白清晰地聚类到TIFY、PPD、ZML和JAZ四个亚家族中。其中，JAZ亚家族成员最多，并可进一步细分为五个亚组（JAZ I-V），但未发现荔枝有成员归属于JAZ I亚组。

3.3. LcTIFY基因的保守基序、结构域和基因结构

结构特征分析表明，同一亚家族的LcTIFY基因具有相似的保守基序、蛋白结构域和基因结构模式。所有LcTIFY蛋白都包含核心的Motif 1和TIFY结构域。PPD亚家族额外包含一个JAS结构域和一个独特的Motif 6；ZML亚家族包含CCT和GATA结构域；而JAZ亚家族则包含TIFY和JAS两个结构域。这些基因的外显子数目在2到16之间不等。

3.4. LcTIFY基因中的miRNA靶位点

预测分析在13个（92.86%）LcTIFY基因的编码区（CDS）中发现了33个潜在的miRNA靶位点，其中LcZIM基因的靶位点最多（5个），而LcJAZ4未预测到任何miRNA靶位点。这提示miRNA介导的转录后调控可能在调控LcTIFY基因功能中扮演重要角色。

3.5. LcTIFY基因的顺式作用元件分析

对LcTIFY基因起始密码子上游2000 bp的启动子区域进行分析，共鉴定出381个非核心的顺式作用元件。这些元件主要分为四类：光响应元件（占50.13%，如Box 4、GA-motif）、激素响应元件（占30.18%，如脱落酸响应元件ABRE、茉莉酸甲酯/水杨酸响应元件）、非生物胁迫响应元件（占15.49%，如厌氧诱导必需元件ARE、MYB结合位点MBS）以及生长发育相关元件（占4.20%，如CAT-box）。这表明LcTIFY基因的表达可能受到光、多种激素、环境胁迫和发育信号的多重精密调控。

3.6. 蛋白质三维结构分析

二级结构预测显示，无规则卷曲是所有LcTIFY蛋白的主要结构成分（占73.88–88.94%），其次是α-螺旋（6.39–25.99%）和β-折叠（1.8–6.72%）。三维结构建模显示，ZML亚家族内部（LcZML1和LcZIM2）以及JAZ亚家族中的特定成员对（LcJAZ3/LcJAZ4和LcJAZ7/LcJAZ8）之间结构高度相似，暗示它们可能存在功能冗余。而TIFY、PPD亚家族成员及其他JAZ成员则呈现出更多样的三维构象。

3.7. LcTIFY基因的基因组分布、复制、共线性和进化

14个LcTIFY基因不均匀地分布在8条染色体上，其中1号染色体分布最多（4个）。基因复制分析未发现串联复制事件，但鉴定出一个片段重复对（LcPPD1/LcPPD2）。该重复对的非同义替换率与同义替换率比值（Ka/Ks）为0.267，小于1，表明该基因对在进化过程中经历了强烈的纯化选择，片段复制是LcTIFY基因家族扩张的主要驱动力。比较基因组共线性分析显示，荔枝与拟南芥、水稻、苹果分别存在12、5和27对共线性基因对，其中与同为双子叶植物的苹果共线性关系最为密切，这为理解LcTIFY基因在被子植物中的进化轨迹提供了线索。

3.8. LcTIFY基因的组织特异性表达分析

基于“妃子笑”品种不同组织的RNA-Seq数据分析表明，LcTIFY基因呈现出明显的组织特异性表达模式。例如，LcPPD1在雌花中表达量最高；LcZML2、LcZIM、LcJAZ1和LcJAZ7主要在叶片中表达；LcJAZ2、LcJAZ3和LcJAZ4偏好于在雄花中表达；而LcJAZ5和LcJAZ8则在果皮中相对高表达。这种表达特异性暗示了不同LcTIFY基因在荔枝各组织器官发育中可能具有独特功能。

3.9. 果皮着色过程中LcTIFY基因的时序表达谱

为了探究LcTIFY基因在果皮着色中的功能，研究通过对“妃子笑”荔枝进行外源ABA（促着色）和CPPU（抑制着色）处理，动态分析了处理过程中果皮生理指标及相关基因的表达。结果表明，ABA处理显著促进了果皮着色和花青素积累，而CPPU处理则强烈抑制了这一过程，但两者对果肉的可溶性固形物（SSC）和可滴定酸（TA）含量影响不显著。

转录组和qRT-PCR分析揭示了LcTIFY基因在着色过程中的复杂表达动态。相关性分析发现，三个基因的表达与花青素积累存在显著关联：LcPPD1和LcJAZ5在对照和ABA处理下的表达与花青素积累呈负相关，但LcJAZ5在CPPU处理下转为正相关。与此相反，LcJAZ7在所有处理下（对照、ABA、CPPU）的表达均与花青素含量呈正相关。这些结果表明，LcPPD1和LcJAZ5可能是荔枝果皮花青素积累的潜在负调控因子，而LcJAZ7则可能是一个潜在的正调控因子。

4. 讨论

本研究在染色体级别的荔枝基因组中鉴定出14个TIFY基因，数量与龙眼、苹果、桃等近缘物种相当。系统发育、结构和表达分析均支持它们作为功能性转录因子的分类。启动子分析提示LcTIFY基因的表达受到多种内外信号的精密调控。进化分析表明，片段复制伴随强烈的纯化选择是LcTIFY家族扩张的主要机制。与水稻（单子叶植物）较少的共线性基因对相比，荔枝与拟南芥、苹果（双子叶植物）存在更多的共线性关系，反映了单双子叶植物分化后的不同进化路径。

尤为重要的是，本研究首次在荔枝中揭示了TIFY基因家族成员与果实着色的潜在联系。组织特异性表达模式暗示了它们功能的多样化。在“妃子笑”果皮着色关键期的表达谱与相关性分析中，我们锁定了三个关键候选基因：LcPPD1、LcJAZ5和LcJAZ7。其中，LcPPD1和LcJAZ5在大多数情况下表现为潜在的负调控因子，而LcJAZ7则表现为潜在的正调控因子。值得注意的是，LcJAZ5在促着色（ABA）和抑着色（CPPU）不同处理下与花青素的相关性发生反转，这暗示其调控机制可能更为复杂，受激素信号网络的交叉调控。这些发现与在其他物种（如苹果、梨、龙眼）中报道的TIFY基因（如JAZ亚家族成员）可正可负地调控花青素合成的结论相一致，为理解荔枝，特别是“妃子笑”这类着色不良品种的果皮着色分子机制提供了新的基因资源和理论依据。

5. 结论

本研究首次在荔枝中完成了TIFY基因家族的全基因组鉴定与综合分析，共鉴定出14个LcTIFY基因，并将其分为TIFY、ZML、PPD和JAZ四个亚家族。所有成员均含有特征性的TIFY结构域和Motif 1，并预测定位于细胞核。进化分析揭示片段复制是该家族扩张的主要驱动力。表达分析表明LcTIFY基因具有组织表达特异性，并首次发现LcPPD1、LcJAZ5和LcJAZ7三个基因的表达与“妃子笑”荔枝果皮花青素积累显著相关，其中LcPPD1和LcJAZ5可能起负调控作用，而LcJAZ7可能起正调控作用。这些基因是后续进行功能验证（如转基因、基因编辑等）以阐明其在荔枝果皮着色中具体分子机制的高优先级候选基因。本研究为深入探究TIFY基因在荔枝中的功能奠定了基础，并为通过分子手段改良荔枝果实外观品质提供了宝贵的遗传资源和新的研究方向。