《Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity》：Gut Microbiota Associated with Type 2 Diabetes and Dietary Balance in Older Adults: A Longitudinal Community-Based Cohort in China
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本前瞻性队列研究（包含巢式病例对照分析）发现，Roseburia菌属丰度降低与老年人群的2型糖尿病（T2D）患病及发病风险显著相关，且大豆摄入不足可能通过影响该菌群来介导疾病风险。研究强调了肠道微生物（特别是产丁酸盐菌）在老年T2D发病中的作用，为通过膳食干预（如增加豆类摄入）调控菌群以预防疾病提供了科学依据。
摘要
目的：本研究通过一项前瞻性队列及巢式病例对照分析，旨在识别中国老年人中与2型糖尿病（T2D）相关的肠道微生物类群，并探讨膳食平衡是否影响这些糖尿病相关的微生物特征。
患者与方法：研究纳入了来自老年人残疾与认知障碍监测与管理（SUM-DCI）队列的507名65岁及以上的社区居住老年人。在基线收集粪便样本，并使用16S核糖体RNA（16S rRNA）基因测序分析肠道微生物组成。糖尿病状态依据空腹血糖浓度≥7.0 mmol/L或自我报告的医生诊断来定义。在基线非糖尿病人群中进行了包含93名个体（31例病例）的巢式病例对照研究，以评估前瞻性关联。使用Metastats和多元线性模型关联分析（MaAsLin）来识别与糖尿病相关的微生物类群。通过自我报告的食物频率问卷评估膳食摄入，并使用中国膳食平衡指数-22（DBI-22）量化膳食平衡。采用多变量逻辑回归评估膳食平衡与肠道微生物丰度之间的关联。
结果：Roseburia的丰度在2型糖尿病患者中显著降低（FDR校正后P< 0.05）。较高的基线Roseburia丰度与较低的糖尿病发病风险相关（OR: 0.225, 95% CI: 0.115–0.818, P<0.05）。大豆摄入量低与Roseburia丰度降低独立相关（OR: 0.61, 95% CI: 0.39–0.94, P<0.05），而总体膳食失衡评分则无显著关联。
结论：Roseburia丰度降低与中国老年人的2型糖尿病患病及未来发病风险相关。大豆摄入量低可能导致这种微生物消耗，这提示了饮食习惯通过调节肠道微生物群影响糖尿病风险的潜在机制。
引言
2型糖尿病是一种在全球范围内高度流行的慢性代谢性疾病。肠道微生物群在2型糖尿病的发病机制和进展中被日益认为是一个关键因素。肠道微生物群落的改变可以调节胰岛素敏感性、葡萄糖代谢和低度慢性炎症，这些是糖尿病发展的关键途径。特别是，产短链脂肪酸（SCFAs）细菌的消耗和促炎类群的富集与高血糖和胰岛素抵抗密切相关。然而，现有研究结果存在不一致性，且针对老年人群的纵向研究较少。膳食因素，如高纤维或植物性饮食模式，强烈影响产SCFAs肠道微生物的组成和功能。膳食平衡反映了对主要食物组指南推荐摄入量的依从性，可能特别与产SCFAs的微生物群落相关。本研究利用SUM-DCI队列数据，主要目的是识别老年人中与2型糖尿病相关的肠道微生物特征，并探索膳食平衡与微生物标志物之间的关系。
材料与方法
研究设计：本研究参与者来自2018年8月至2019年1月建立的SUM-DCI队列，包括来自辽宁省元宝区和新疆维吾尔自治区库尔勒市的1972名65岁以上成年人。2019年4月，建立了一个包含690名随机选择的个体的肠道微生物亚队列。亚队列的纳入标准是完成基线调查的老年人。排除标准包括：患有神经系统疾病或其他严重疾病者；过去五年内有胃肠道手术史者；有肠切除、炎症性肠病、肠易激综合征、持续性胃肠炎、慢性腹泻、结肠炎、艰难梭菌感染或慢性便秘病史者；以及在过去三个月内使用过全身性抗生素或高剂量益生菌者。研究参与者的选择过程如图1所示。
基线和随访时的糖尿病评估：糖尿病定义为空腹血糖（FPG）≥ 7.0 mmol/L和/或自我报告的院内诊断。在基线和随访时从静脉血样本中测量FPG。发病糖尿病定义为基线时无糖尿病的参与者中发生符合上述标准的糖尿病。
粪便样本采集、DNA提取和16S rRNA基因测序：指示参与者在排便后立即收集粪便样本，并在30分钟内将样本送至指定中心。收到后，样本立即登记，密封在无菌容器中，并保存在-80°C作为长期储存条件。使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）/十二烷基硫酸钠（SDS）方法提取微生物基因组DNA，随后进行16S rRNA基因的PCR扩增和文库制备。对原始读数进行质量过滤，在97%相似性水平下聚类为操作分类单元（OTUs），并根据SILVA数据库进行物种分类注释。数据经过标准化用于下游系统发育和组成分析。
膳食平衡评估：使用食物频率问卷（FFQ）收集基线时过去12个月内43种不同食物类别的膳食消费信息。参与者被要求报告每种食物或食物组的消费频率，然后是消费量的问题。根据修订后的中国膳食平衡指数-22（DBI-22）标准评估膳食平衡。根据参与者报告的每日消费量为七个食物组指标（谷物、蔬菜水果、乳制品和豆制品、动物源食物、酒精和总体食物种类）分配成分分数。成分分数相加得出三个汇总指标：高界分数（DBI-HBS），代表过度摄入的程度；低界分数（DBI-LBS），表示摄入不足；以及膳食质量距离（DBI-DQD），通过汇总所有膳食成分的正负分数绝对值来量化整体膳食失衡。
协变量评估：协变量包括社会人口学特征、生活方式行为和健康状况指标。
统计分析：比较糖尿病和非糖尿病组之间的基线特征。对于连续变量使用t检验，对于分类变量使用卡方检验。为找出基线时与2型糖尿病显著相关的OTUs，应用了两种互补的方法：Metastats分析和多元线性模型关联分析（MaAsLin）。使用Metastats检测2型糖尿病组和非2型糖尿病组之间差异丰度的类群。使用MaAsLin分析类群的相对丰度，以评估它们与2型糖尿病的关联，同时调整潜在的混杂因素。使用Benjamini–Hochberg程序进行多重检验校正，FDR校正后P< 0.05被认为具有统计学意义。为了验证已识别基线类群的预测价值，在最终清理后的队列中进行了一项为期三年的随访巢式病例对照分析。在基线时非糖尿病的个体中，确定发生2型糖尿病的个体为病例。对照组选自整个随访期间未患糖尿病的参与者。病例和对照按1:2的比例根据性别和居住地区进行匹配。在该巢式样本中，应用条件逻辑回归模型来估计与糖尿病相关类群相对丰度每单位变化相关的2型糖尿病发病优势比（ORs）和95%置信区间（CIs）。构建了三个模型。选择与2型糖尿病发病表现出稳健负相关的糖尿病相关类群进行膳食评估。然后使用基线膳食数据，通过多变量逻辑回归分析评估膳食质量与这些选定微生物类群之间的关系。构建了三个逻辑回归模型。由于DBI定义的类别内数据分布存在严重不平衡，为了避免有偏或不稳定的统计估计，糖摄入量和膳食多样性这两个组成部分被排除在后续分析之外。
结果
人口统计学特征：经过数据清理并排除关键变量缺失或粪便或膳食数据无效的参与者后，最终分析样本包括507名老年人。参与者的基线特征根据糖尿病状况显示。在507名参与者中，基线时有120人患有糖尿病，387人无糖尿病。参与者的平均年龄为71.74岁，男性占45.17%。与无糖尿病者相比，糖尿病患者更有可能是男性且高血压患病率更高（P<0.05）。两组之间在生活方式因素方面无显著差异。
2型糖尿病组和非2型糖尿病组的基线肠道微生物组成：从507个样本中共测序得到58,031,495条读数，经过拼接和过滤后生成57,236,330条clean tags，平均每个样本165,662条clean tags。在97%相似性水平下，所有样本共获得11,019个OTUs。2型糖尿病组和非2型糖尿病组中前10大肠道微生物门的相对丰度显示，厚壁菌门和拟杆菌门在两组中均占主导地位。
肠道微生物群与糖尿病患病率的关联：Metastats分析显示，2型糖尿病组和非2型糖尿病组之间的肠道微生物组成存在显著差异。Roseburia在非2型糖尿病组中丰度显著更高（P< 0.01），而Collinsella在2型糖尿病组中丰度显著更高（P< 0.05）。
MaAsLin分析的结果显示，在2型糖尿病患者中，显著相关的类群包括：Roseburia（OTU_4870）的丰度显著降低（Q < 0.05），而Bacteroides（OTU_11002）和Bifidobacterium bifidum（OTU_3633）的丰度均显著更高（FDR校正后P< 0.05）。
肠道微生物群与糖尿病发病的关联：在基线时387名非糖尿病个体中，31人在随访期间患上2型糖尿病，并与62名对照匹配，最终分析样本为93人。条件逻辑回归模型显示，基线Roseburia丰度（OTU_4870）较高的参与者患2型糖尿病的风险显著较低，在未调整模型中OR为0.306（95% CI: 0.115–0.818, P<0.05）。在后续调整了人口统计学和生活方式因素的模型中，这种关联仍然稳健，在最终模型中OR为0.225（95% CI: 0.115–0.818, P<0.05）。OTU_11002或OTU_3633均未观察到统计学上的显著关联。
Roseburia丰度与DBI指数的关联：总体而言，研究参与者表现出中度膳食摄入不足（DBI_LBS: 26.92±10.15）和低水平的过度摄入（DBI_HBS: 3.48±4.84），导致总体膳食失衡程度为中度（DBI_DQD: 30.40±9.05）。膳食失衡-低（摄入不足）平衡评分（DBI_LBS）或膳食失衡-高（过度摄入）平衡评分（DBI_HBS）均未显示与Roseburia丰度有统计学上的显著关联。然而，在DBI成分中，低大豆摄入量与较低的Roseburia高丰度几率在调整后的模型中持续相关。
讨论
本研究表明，在中国老年队列中，Roseburia的相对丰度与2型糖尿病的患病率和发病率均存在显著的负相关。大豆摄入量低与Roseburia丰度降低独立相关。这些发现与之前的研究一致，表明Roseburia丰度与2型糖尿病呈负相关。已提出几种机制解释。首先，Roseburia spp.是肠道中重要的丁酸盐生产者，利用乙酰辅酶A转移酶途径将膳食纤维转化为短链脂肪酸（SCFAs），主要是丁酸盐。丁酸盐是一种关键的信号分子，可调节宿主代谢。它通过激活肠内分泌细胞上的游离脂肪酸受体2和3（FFAR2和FFAR3）促进胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和肽YY（PYY）的分泌，从而增强胰岛素分泌和饱腹感。此外，丁酸盐激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）并抑制组蛋白去乙酰化酶，促进脂肪酸氧化并改善胰岛素敏感性。它还是结肠细胞的主要能量来源，并支持肠道屏障完整性。其次，Roseburia通过调节炎症来促进免疫稳态。其代谢物促进白细胞介素-10（IL-10）和白细胞介素-22（IL-22）的产生以及调节性T细胞的分化，同时通过抑制核因子κB（NF-κB）通路抑制促炎细胞因子。这种平衡的破坏可使免疫环境转向慢性促炎状态，从而加剧胰岛素抵抗。第三，Roseburia spp.产生一系列生物活性化合物。
研究未观察到总体DBI汇总评分与Roseburia丰度之间的显著关联。一个可能的解释是，DBI汇总评分包含多个食物组成分，因此可能掩盖了与微生物组成的食物组特异性关联。值得注意的是，在食物组特异性水平上，较低的大豆摄入量与较低的Roseburia丰度相关，且独立于年龄、身体质量指数（BMI）、教育程度和生活方式因素。这一发现与之前的研究一致。对此有几种潜在的机制解释。首先，大豆富含膳食纤维和不可消化的寡糖，如棉子糖和水苏糖，它们是Roseburia等产SCFAs细菌的优先底物。这些可发酵成分支持微生物生产丁酸盐，从而创造一个有利于产丁酸盐类群增殖的肠道环境。其次，大豆来源的生物活性化合物，包括异黄酮，通过刺激有益类群和抑制促炎细菌来调节肠道微生物组成，从而有助于形成更有利的微生物构型。第三，纤维发酵的影响可能增强肠道屏障完整性和免疫稳态，在这些条件下Roseburia更有可能茁壮成长，从而加强习惯性大豆摄入与维持有益微生物种群之间的联系。
本研究有几个显著优势。首先，它整合了横断面和前瞻性巢式病例对照分析。其次，调查是在一个特征良好的中国老年人社区队列中进行的。第三，同时使用Metastats和MaAsLin确保了稳健地检测差异丰度类群，而在匹配的病例对照框架中使用条件逻辑回归有效地控制了关键的人口统计学混杂因素。此外，通过将详细的膳食数据与微生物组谱整合，该研究能够探索潜在的膳食-微生物群-糖尿病通路。
尽管有其优势，但本研究也有几个局限性。首先，膳食摄入数据基于自我报告信息，可能引入错误分类或回忆偏倚。其次，按地区和性别匹配可能导致过度匹配，从而削弱检测真实关联的能力。第三，16S rRNA测序主要在属或OTU水平提供分类学分辨率，这阻碍了在更精细分类水平（如物种）上识别微生物。最后，鉴于发病病例数量较少，研究可能效力不足，无法检测到较弱的关联，并且可能未检测到其他与糖尿病相关的类群。
结论
本研究表明，在中国老年队列中，Roseburia的相对丰度与2型糖尿病的患病率和发病率均存在显著关联，并且大豆摄入量低与Roseburia丰度降低独立相关，这表明如果这些发现得到验证，全科医生可以建议增加豆类消费或补充富含Roseburia的补充剂以预防2型糖尿病。未来需要结合多组学的研究来精确定义物种水平的微生物类群以及连接饮食、肠道微生物群和2型糖尿病的因果通路。
