RP14914P：靶向潜伏性结核感染的免疫信息学设计与评估及其多表位mRNA疫苗研发

《Pathogens》：Immunoinformatic Design and Evaluation of a Multi-Epitope mRNA Vaccine RP14914P Targeting Latent Tuberculosis Infection Yuan Tian, Mingming Zhang, Syed Luqman Ali, Aigul Abduldayeva, Shuang Zhou, Yajing An, Yufeng Li, Ruizi Ni, Lingxia Zhang and Wenping Gong + 2 authors

本研究通过免疫信息学与反向疫苗学策略，设计并评估了靶向结核分枝杆菌潜伏相关抗原的多表位mRNA疫苗RP14914P。该疫苗整合了细胞毒性T细胞、辅助T细胞和B细胞表位，并内置TLR2/4双重佐剂系统，旨在激发全面的Th1型免疫应答，以阻断潜伏感染（LTBI）向活动性结核（ATB）的复发，为填补现有BCG疫苗的预防空白提供了新的候选策略。

　　

背景

结核病（TB）是由结核分枝杆菌复合群（MTBC）引起的慢性传染病，仍是全球重大健康威胁。其防控的一个核心难点在于潜伏性结核感染（LTBI）的高流行率和再激活风险。据估计，全球近四分之一人口（约20亿）为MTBC潜伏感染者，其中超过85%的活动性结核病例可归因于LTBI的再激活。目前唯一获批的卡介苗（BCG）对成人保护效力不均，且无法有效阻止潜伏感染向活动期的转变。近年来，mRNA疫苗技术因其设计灵活、可同时激活MHC-I和MHC-II途径等优势，为开发新型结核疫苗，特别是针对LTBI阶段的疫苗，提供了革命性机遇。

材料与方法

本研究采用了一套系统的免疫信息学与反向疫苗学流程。首先，从Mycobrowser数据库中检索了七个经文献证实与潜伏期相关的结核分枝杆菌H37Rv菌株抗原（Rv1736c, Rv1980c, Rv2656c, Rv2659c, Rv3872, Rv3873, Rv3879c）。接着，利用IEDB数据库的NetMHCpan-4.1和NetMHCIIpan-4.1工具分别预测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助T淋巴细胞（HTL）表位，并利用ABCpred服务器预测线性B细胞表位。所有表位均经过抗原性（VaxiJen v2.0）、过敏性（AllerTOP v.2.1）和毒性（ToxinPred2.0）的安全性验证，HTL表位还额外筛选了可诱导干扰素-γ（IFN-γ）而不诱导白细胞介素-4（IL-4）和IL-10分泌的、偏向Th1免疫应答的表位。

筛选出的优势表位通过特定氨基酸接头（AAY连接CTL表位，GPGPG连接HTL表位，KK连接B细胞表位）进行串联组装。为了增强疫苗的免疫原性，在构建体的N端通过EAAAK刚性接头加入了Toll样受体2（TLR2）激动剂Psmα4、通用辅助肽PADRE以及TLR4激动剂Rpfe，C端添加了6×His标签以便于纯化。最终构建的mRNA疫苗被命名为RP14914P。

随后，对RP14914P进行了全面的计算机模拟分析：使用ExPASy ProtParam和Protein-sol分析其理化性质与溶解度；通过IEDB工具计算其HLA表位的全球人群覆盖率；利用PSIPRED和AlphaFold-3预测并优化其二、三级结构，并通过ProSA-web、ERRAT和Ramachandran图验证模型质量；使用ClusPro 2.0进行与TLR2/TLR4的分子对接，并通过100纳秒分子动力学模拟评估复合物稳定性；利用C-ImmSim服务器进行免疫反应模拟；最后，使用ExpOptimizer工具对编码序列进行人源密码子优化，并用RNAfold预测mRNA二级结构稳定性。

结果

1. 1.
   疫苗设计与组装：经过三步筛选策略，从初始表位池中最终确定了31个CTL表位、13个HTL表位和14个B细胞表位。通过随机组合与比较筛选，确定了包含14个CTL、9个HTL和14个B细胞表位的最佳骨架（支架13）。进一步与不同TLR激动剂组合评估后，最终选定TLR2激动剂Psmα4和TLR4激动剂Rpfe，组装成最终的mRNA疫苗RP14914P。其mRNA序列结构从5‘到3’依次为：5‘ m7G帽—5’ UTR—Kozak序列—信号肽—EAAAK—Psmα4—GPGPG—PADRE—GPGPG/AAY—CTL表位—GPGPG—HTL表位—KK—B细胞表位—EAAAK—Rpfe—6×His—MITD序列—3‘ UTR—多聚A尾。
2. 2.
   结构与理化性质：RP14914P是一个由866个氨基酸组成、分子量约90.4 kDa的多肽。二级结构预测显示其包含27.25%的α-螺旋、12.70%的延伸链和60.05%的无规卷曲。经AlphaFold-3建模和GalaxyRefine优化后，三级结构模型的Ramachandran图显示有97.5%的残基位于最允许区域，模型质量高。疫苗具有强抗原性（VaxiJen评分0.7797）和免疫原性（IEDB评分8.58629），无预测毒性和过敏性。理化性质分析表明其不稳定指数为28.65（<40），在^大肠杆菌中的预测溶解度为0.513（>0.45），理论等电点（pI）为9.61，均为有利指标。
3. 3.
   表位保守性与人群覆盖率：对疫苗所含37个核心表位在87个分枝杆菌菌株（包括MTBC主要谱系和非结核分枝杆菌NTM）中的保守性分析显示，超过50%的表位在全部测试菌株中序列一致性达100%，其余表位也保持高度同源性（大多≥80%），表明疫苗具有诱导广谱免疫保护的潜力。人群覆盖率分析显示，其MHC-I和MHC-II表位的全球预估覆盖率分别达到82.35%和99.67%，显示出广泛的潜在适用性。
4. 4.
   分子对接与动力学模拟：分子对接显示RP14914P与TLR2和TLR4具有极高的结合亲和力，结合能分别为-1477.8 kcal/mol和-1480.1 kcal/mol。100 ns分子动力学模拟表明，RP14914P-TLR2/4复合物能快速达到平衡并保持结构稳定。其中，RP14914P-TLR2复合物构象集中、高度稳定，而RP14914P-TLR4复合物则表现出更高的构象柔性，这种“稳定与动态并存”的特性可能有利于在不同免疫微环境中有效激活TLR信号通路。
5. 5.
   免疫模拟：C-ImmSim免疫模拟预测RP14914P能激发强劲的多层次免疫应答。先天免疫方面，自然杀伤细胞（NK细胞）在90天达到峰值并保持稳定，巨噬细胞和树突状细胞持续活化。适应性免疫方面，疫苗能诱导强烈的T细胞和B细胞反应：辅助T细胞（T_H）和细胞毒性T细胞（T_C）均出现多个活化峰；记忆B细胞在免疫后5-10天内急剧增加。细胞因子谱以Th1型为主，干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）分泌水平显著升高。
6. 6.
   mRNA序列优化：经人源密码子优化后，RP14914P的mRNA序列（2598 nt）密码子适应指数为0.81，GC含量61.09%。RNAfold预测其最低自由能为-1213.9 kcal/mol，表明其mRNA二级结构热力学稳定，有利于在哺乳动物细胞中高效、持久表达。

讨论

本研究设计的RP14914P疫苗在多个方面展现出创新性和优势。与早期基于单一抗原（如ESAT6）或非潜伏期抗原的TB mRNA疫苗相比，RP14914P首次系统整合了七个明确的潜伏相关抗原的优势表位，针对性更强。与同类多表位疫苗相比，其整合的B细胞表位数量更多，有利于激发更强的体液免疫。采用TLR2/4双重激动剂设计，比单一TLR佐剂疫苗能更全面地模拟天然免疫识别模式。其与TLR2/4的结合能显著低于研究团队此前设计的其他疫苗候选物，预示着更强的先天免疫激活潜力。

在安全性、理化性质和人群覆盖方面，RP14914P的综合表现优于或相当于部分已进入临床试验的候选疫苗（如RUTI疫苗）或其他计算机设计的疫苗。其结构模型质量高，分子动力学模拟揭示的与TLR4复合物的构象柔性可能有助于实现适应性免疫调节。免疫模拟结果预测其能诱导协调、强效且持久的Th1极化免疫应答，与抗结核免疫的需求相符。

结论

综上所述，本研究运用免疫信息学与反向疫苗学方法，成功设计并全面评估了靶向潜伏性结核感染的多表位mRNA疫苗RP14914P。该疫苗整合了来自七个潜伏相关抗原的37个高置信度T/B细胞表位，并采用内置TLR2/4双重佐剂系统增强免疫激活。计算分析预测其具有稳定的结构、良好的理化性质、广泛的表位保守性与人群覆盖率、与TLR2/4的高亲和力及稳定性，并能激发强大的Th1型细胞免疫与持久的体液免疫记忆。这些计算机模拟结果为RP14914P作为预防LTBI再激活的潜在新一代结核疫苗候选物提供了有力支持。然而，所有发现均基于计算机预测，其实际的免疫原性、安全性及保护效力仍需后续系统的体外与体内实验予以验证。本研究为此提供了详尽的免疫信息学蓝图，可加速后续实验开发进程。