基于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌gadA与speA基因异源表达提升植物乳杆菌酸胁迫耐受性与发酵活性的研究

《Fermentation》：Heterologous Expression of gadA and speA from Alicyclobacillus acidoterrestris Enhances the Acid Resistance and Fermentative Activity of Lactiplantibacillus plantarum Xiya Cao, Linan Duan, Yurou Ren, Hao Liang, Kexin Li, Xinyao Guo, Jiali Wang, Junmei Ma and Junnan Xu

本研究报道了通过异源表达嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶基因(gadA)和精氨酸脱羧酶基因(speA)，成功增强了模式益生菌植物乳杆菌(L. plantarum)的酸胁迫耐受性。工程菌株在低pH环境下维持更高的细胞内pH和ATP水平，细胞膜完整性更好，关键酸应激基因表达上调，发酵性能显著提升。该工作为创制高抗逆性工业益生菌提供了新策略，对果汁发酵、胃肠道定植等应用具有重要参考价值。

　　

1. 引言

乳酸菌(LAB)是公认的商业化益生菌，其中植物乳杆菌(L. plantarum)是一种公认安全(GRAS)的益生菌，具有调节肠道菌群、降胆固醇、抗菌、抗氧化、吸附重金属和免疫调节等多种有益功能。其最适生长pH约为6.5，但在胃肠道定植及果汁、果酒等发酵应用中，需要耐受pH低于4.0的强酸环境。提高其酸耐受性是增强其益生功能及工业应用性能的关键。多种策略已被用于提高乳酸菌的酸耐受性，其中异源表达耐酸基因是一种能够稳定、定向提高耐酸性的有前景的方法。

嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌(A. acidoterrestris)具有很强的耐酸性，最适生长pH为4.0，最低可耐受pH约2.2，是果汁中著名的腐败菌，同时也是耐酸基因和酶的重要来源。前期研究表明，氨基酸代谢，特别是谷氨酸和精氨酸的脱羧途径，在其酸胁迫适应中起关键作用。因此，利用A. acidoterrestris的耐酸基因来增强L. plantarum的耐受性，是克服当前食品发酵过程局限、提高其在胃肠道中功能稳定性的合理策略。

基于此，本研究旨在通过异源表达A. acidoterrestris DSM 3922^T的谷氨酸脱羧酶基因(gadA)和精氨酸脱羧酶基因(speA)，来增强L. plantarum WCFS1的酸耐受性，并通过评估重组菌株的生长性能、细胞内pH、ATP含量、基因表达和酶活性，系统评价其酸胁迫响应，阐明这些耐酸基因在赋予增强应激抗性中的功能作用。

2. 材料与方法

2.1. 菌株与质粒

研究使用的菌株和质粒详情见文中表格。

2.2. 菌株活化与培养

A. acidoterrestris DSM 3922^T在AAM培养基中于45°C活化培养。L. plantarum WCFS1在MRS培养基中于37°C活化培养。

2.3. DNA操作、质粒构建与转化

从A. acidoterrestris中提取基因组DNA，PCR扩增gadA和speA基因，将其克隆至表达载体pMG36e，构建重组质粒pMG36e-gadA和pMG36e-speA。通过电穿孔法将重组质粒导入L. plantarum WCFS1感受态细胞中，利用红霉素抗性筛选阳性转化子，并通过菌落PCR和测序验证。

2.4. 重组植物乳杆菌酸耐受性测定

将重组菌株接种于不同pH（6.2至3.0）的MRS培养基中，使用Bioscreen C自动生长曲线分析仪在37°C静态培养100小时，监测OD₆₀₀。利用修正的Gompertz模型拟合生长数据，评估重组菌株的酸耐受性，并计算最大比生长速率(μ_max)、延滞期(λ)和世代时间(Tg)等生长动力学参数。

2.5. 关键基因表达分析

将重组菌株在pH 6.2（对照）、4.0和3.0的MRS培养基中处理1小时，提取总RNA并反转录为cDNA。通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测gadA和speA基因的表达水平，以tuf基因作为内参，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

2.6. 细胞膜完整性评价

使用LIVE/DEAD^?BacLight?试剂盒评估酸胁迫下重组菌株的细胞膜完整性。将处于对数中期的菌体用pH 4.0或3.0的MRS培养基处理1小时后，与SYTO 9/PI染色液混合，用酶标仪检测绿色(535 nm)和红色(640 nm)荧光强度。通过活/死细胞比例标准曲线计算样品的膜完整性百分比。

2.7. 细胞内pH测定

采用BCECF-AM荧光探针法测定酸胁迫下重组菌株的细胞内pH。用不同pH（3.0-8.0）的校准缓冲液平衡细胞内外pH后，用BCECF-AM染色，测量490/440 nm激发波长下的525 nm发射荧光。计算校正荧光强度(I)，并根据其与pH的线性关系标准曲线计算样品细胞内pH。

2.8. ATP含量测定

使用ATP检测试剂盒测定酸胁迫下重组菌株的ATP含量。将处理后的菌体裂解，与荧光素酶反应液混合，用酶标仪检测生物发光强度，根据ATP标准曲线计算样品ATP浓度。

2.9. 谷氨酸脱羧酶(GAD)和精氨酸脱羧酶(ADC)活性测定

通过检测反应体系中产生的CO₂或胺类产物来测定GAD和ADC活性。

2.10. 发酵活性评估

将重组菌株接种于苹果汁中，在37°C发酵，定期取样测定pH、可滴定酸度、活菌数和有机酸含量，评估其发酵性能。

2.11. 数据分析

所有实验至少重复三次，数据以平均值±标准差表示，采用适当统计方法分析组间差异。

3. 结果

3.1. 重组菌株的构建与验证

成功构建了重组表达质粒pMG36e-gadA和pMG36e-speA，并通过电转化和抗性筛选获得了重组菌株L. plantarum-gadA和L. plantarum-speA，经PCR和测序验证正确。

3.2. 重组菌株的酸耐受性增强

与对照菌株相比，重组菌株L. plantarum-gadA和L. plantarum-speA在pH 4.0至3.0的酸性条件下表现出显著更高的存活率和生长能力。生长动力学分析显示，在pH 3.8及以下，重组菌株的最大比生长速率(μ_max)更高，延滞期(λ)更短，世代时间(Tg)更短，表明其酸胁迫下的生长恢复和适应能力更强。

3.3. 酸胁迫下关键基因表达上调

qPCR结果显示，在pH 4.0和3.0的酸胁迫下，重组菌株L. plantarum-gadA和L. plantarum-speA中gadA和speA基因的表达水平均显著上调，表明外源基因在胁迫下被有效激活。

3.4. 细胞膜完整性得到更好的维持

膜完整性检测表明，在pH 4.0和3.0处理1小时后，重组菌株的细胞膜完整性百分比显著高于对照菌株，说明异源表达的耐酸基因有助于保护细胞膜在酸胁迫下的完整性。

3.5. 细胞内pH和ATP水平更高

在酸胁迫下，重组菌株维持了显著高于对照菌株的细胞内pH和ATP含量。更高的细胞内pH有助于维持胞内酶活性和代谢稳态，而充足的ATP则为抗胁迫响应和细胞修复提供了能量保障。

3.6. GAD和ADC酶活性增强

酶活测定证实，重组菌株在酸胁迫下的谷氨酸脱羧酶(GAD)和精氨酸脱羧酶(ADC)活性显著高于对照，这与其基因表达上调的结果一致。这两种脱羧酶通过消耗胞内质子(H⁺)产生胺类物质，是细菌对抗酸胁迫的重要生化机制。

3.7. 发酵性能提升

苹果汁发酵实验表明，与对照菌株相比，重组菌株L. plantarum-gadA和L. plantarum-speA在发酵过程中能更快地降低果汁pH，产生更多的乳酸，并维持更高的活菌数，显示出更优的发酵启动能力和整体发酵活性。

4. 讨论

本研究成功将来源于极端耐酸菌A. acidoterrestris的gadA和speA基因在L. plantarum中实现异源表达。结果表明，这两种基因的引入从多个层面系统性增强了受体菌的酸胁迫抗性。在分子层面，酸胁迫诱导了外源基因的表达，并提高了相应脱羧酶的活性。在生理层面，重组菌株在酸胁迫下能更好地维持细胞膜完整性、胞内pH稳态和ATP水平。这些有利的生理生化变化最终转化为更强的生长能力和更优的发酵性能。该工作不仅为阐明细菌酸胁迫适应机制提供了新的视角，更重要的是，为通过合成生物学和代谢工程策略定向改造和强化工业益生菌的胁迫抗性提供了切实可行的方案和理论依据，在功能性发酵食品开发和下一代高性能益生菌制剂研制方面具有潜在应用价值。

5. 结论

异源表达A. acidoterrestris的谷氨酸脱羧酶基因(gadA)和精氨酸脱羧酶基因(speA)可有效提高L. plantarum WCFS1的酸耐受性。工程菌株在酸胁迫下关键基因表达上调、酶活性增强、细胞膜更完整、能维持更高的胞内pH和ATP水平，并表现出更优的果汁发酵性能。该研究为开发具有增强胁迫抗性的工业益生菌菌株提供了新的基因资源和理论支持。