HupA：铜绿假单胞菌Pqs系统与绿脓菌素生物合成的全新转录激活因子

《Applied and Environmental Microbiology》：The nucleoid-associated protein subunit HupA positively regulates the Pqs system and pyocyanin production in Pseudomonas aeruginosa

本研究揭示了细菌染色体相关蛋白HU的α亚基HupA是调控铜绿假单胞菌群体感应（QS）和毒力因子表达的新型特异性转录激活因子。通过全基因组筛选，研究发现HupA可直接结合pqs和phz基因的启动子区域，正向激活Pqs系统及绿脓菌素（PYO）的生物合成，但不影响蛋白酶和鼠李糖脂等其他毒力因子的产生。该发现不仅揭示了HupA调控细菌毒力的新功能，也首次证实了HU亚基具有序列特异性的DNA结合与基因转录激活能力，为理解细菌毒力调控网络提供了新视角。

　　

铜绿假单胞菌是一种普遍存在的革兰氏阴性机会性病原体，可导致免疫功能低下个体（如囊性纤维化、烧伤、呼吸机相关性肺炎患者）发生严重急慢性感染。其毒力与耐药基因的表达受到严格调控，其中群体感应（Quorum Sensing, QS）系统是关键调控机制。铜绿假单胞菌拥有三个特征明确的QS系统：两个基于酰基高丝氨酸内酯的系统（Las和Rhl）以及一个基于喹诺酮的系统（Pqs）。这三个系统以层级方式运作，共同调控关键毒力因子（如蛋白酶、鼠李糖脂和绿脓菌素）的表达。其中，绿脓菌素（Pyocyanin, PYO）因其蓝绿色而最具辨识度。

近年来，临床分离株中频繁出现LasR功能缺失突变株，其QS系统的活性与层级关系是动态的，并受多种胞内外因素影响。尽管已知多种调控系统（如双组分系统和小RNA）可响应环境信号调节QS活性，但其潜在的分子机制仍不清楚。染色体相关蛋白（Nucleoid-Associated Proteins, NAPs）是细菌中含量丰富的小蛋白，在基因组结构、代谢、应激适应和毒力中起关键作用。其中，HU蛋白通常由α亚基（HupA）和β亚基（HupB）组成，主要通过其非特异性DNA结合活性调节多种生理过程。然而，HU蛋白在调节QS（这一控制细菌毒力因子产生的关键细胞间通讯系统）中的潜在作用尚不明确。

本研究从一名泌尿系统感染患儿体内分离到一株铜绿假单胞菌临床分离株PA_HN008。与实验室参考菌株PAO1相比，该菌株在生长后期（24、36和48小时）的静态液体培养中产生了显著更高水平的PYO。对两个负责PYO生物合成的、几乎相同但差异调控的phz操纵子（phz1和phz2）的启动子活性进行分析表明，PA_HN008中PYO的过量产生主要归因于phz1操纵子的高表达。

基因组测序分析显示，PA_HN008属于多位点序列分型（MLST）1239克隆复合体，其基因组中整个lasR基因及邻近的lasI和rsaL基因缺失，是一株Las系统缺失的菌株。通过比较PA_HN008与PAO1在三个QS系统中自诱导剂合成关键基因（lasI、rhlI和pqsA）的表达水平，并结合基因敲除与回补实验，研究发现PA_HN008在生长后期高产的PYO依赖于活跃的RhlI-RhlR-PqsE通路。具体而言，缺失rhlI基因会大幅降低PYO产量，而外源添加自诱导剂C₄-HSL可恢复ΔrhlI突变株的PYO产生。同样，缺失pqsA基因也会导致PYO产量急剧下降。有趣的是，虽然缺失pqsA会大幅下调pqsE的表达，但在此突变株中过表达PqsE可成功恢复PYO的产生。而在ΔrhlI突变株中过表达PqsE则无法提升PYO产量，但若同时外源添加C₄-HSL，则可恢复甚至使PYO产量超过野生型。这证实了PA_HN008中的PYO生物合成受RhlI-RhlR-PqsE通路控制。

基于PA_HN008菌株高产QS控制的毒力因子PYO这一表型，研究团队利用转座子突变技术进行了全基因组筛选，旨在鉴定铜绿假单胞菌中QS的新型调控因子。在以PYO产量降低超过50%为标准筛选出的101个突变株中，除了位于PYO生物合成基因（51个插入）以及Rhl和Pqs系统（1个插入在rhlI，11个插入在pqs基因）的突变外，研究人员将目光聚焦于五个功能未表征的基因。其中，DNA结合蛋白PA5348引起了特别关注。该基因的突变不影响细菌生长，但可显著降低PYO产量，且该功能可通过回补PA5348基因得以恢复。

蛋白质结构比对（使用AlphaFold）显示，PA5348与金黄色葡萄球菌中染色体相关蛋白HU的α亚基具有高度相似性。由于HU蛋白通常是由α和β亚基组成的异源复合体，而PA1804（HupB）已被鉴定为铜绿假单胞菌中的β亚基，研究进一步利用DMFold评估了PA5348与HupB蛋白的相互作用。预测结果显示两者存在相互作用，且PA5348-HupB复合体与金黄色葡萄球菌的HU（HupA-HupB）复合体高度相似。鉴于PA5348与金黄色葡萄球菌HupA的高度相似性，及其在铜绿假单胞菌中与HupB形成复合体的潜力，研究将该基因命名为HupA。

进一步研究发现，无论是在PA_HN008还是PAO1菌株中，缺失hupA基因均会显著降低PYO的产量，但不影响蛋白酶和鼠李糖脂这两种重要QS控制毒力因子的产生。在PA_HN008菌株中构建双缺失突变体ΔhupAΔhupB发现，仅回补hupA基因无法恢复PYO产量，这表明HupA以依赖HupB的方式调控PYO产生。对608个铜绿假单胞菌基因组的分析显示，HupA高度保守，最小相似性达97.8%，表明它可能是铜绿假单胞菌中一个保守的PYO产量正向调节因子。

为了深入理解HupA调控PYO产生的机制，研究进行了RNA测序（RNA-seq），比较了野生型与ΔhupA突变株的转录组谱。结果显示，在ΔhupA突变株中，共有253个基因上调，309个基因下调。与PYO产量降低一致，RNA-seq结果显示phz1、phzM和phzS基因在突变株中下调，而与其他毒力因子（如蛋白酶和鼠李糖脂）产生相关的基因则未受影响。值得注意的是，pqs操纵子中的基因（pqsA, pqsB, pqsC, pqsD, pqsE）在ΔhupA突变株中均显著下调，这表明PYO产量降低可能部分归因于Pqs系统活性的下降，更具体地说是PqsE表达的减少。逆转录定量PCR（RT-qPCR）验证了phz基因以及pqsR和pqsE基因的下调。外源添加Pqs系统的自诱导剂PQS，可以提升ΔhupA突变株中pqsE的表达和PYO产量，表明Pqs系统在突变株中仍具功能，且HupA通过激活Pqs系统（特别是PqsE蛋白）来正向调控PYO产生。然而，缺失hupA仅轻微降低了pqs基因的表达，且即使添加高浓度PQS也只能部分恢复PYO产量，这提示可能存在其他通路介导HupA对PYO产生的调控。

考虑到HupA是一种DNA结合蛋白，研究通过电泳迁移率变动分析（EMSA）检验了HupA是否通过直接与其启动子相互作用来调控pqs基因的表达。实验显示，HupA的存在导致pqsR启动子条带发生明显偏移，pqsA启动子条带发生轻微偏移，表明HupA可以与pqsA和pqsR启动子形成复合物。作为对照，HupA未与recA启动子形成复合物。这些结果表明HupA能特异性识别并结合pqsA和pqsR启动子。既然HupA部分通过Pqs系统调控PYO产生，研究进一步检验了HupA是否结合PYO生物合成基因的启动子。有趣的是，EMSA显示HupA与phzA1和phzA2基因的启动子存在较弱的相互作用。总之，这些结果表明HupA通过激活pqs基因和PYO生物合成基因的转录来正向调控PYO的产生。

本研究成功分离到一株Las缺失但Rhl和Pqs活跃的临床菌株PA_HN008，并证明其在生长后期高产PYO是由于活跃的Rhl和Pqs系统。利用该高产PYO菌株，研究以蓝绿色毒力因子PYO作为快速读数，通过构建突变体文库全面筛选了调控QS活性的遗传元件，从而鉴定出DNA结合蛋白HupA。HupA是HU蛋白的α亚基，它通过特异性且直接地激活pqs基因和PYO生物合成基因的转录，正向调控PYO的产生。尽管HupA对PYO产生的贡献是在临床分离株PA_HN008中发现的，但HupA在铜绿假单胞菌中高度保守，这表明它可能是铜绿假单胞菌中Pqs活性和PYO产生的普遍调节因子。

与其他染色体相关蛋白（如Fis或H-NS）通常在多种细菌物种中对全局基因表达产生广泛调节效应不同，本研究表明HupA的基因调节谱相对较窄。缺失hupA仅导致39个基因上调和63个基因下调（log₂倍数变化大于1.0）。特别值得注意的是，研究发现HupA通过特异性结合其启动子来调节pqs和phz基因的转录，尽管结合细节尚未确定。HupA与启动子（尤其是pqsA和phz启动子）的相互作用并不非常强。这些结果不仅拓宽了我们对NAPs调节特异性的认知（NAPs通常调节多种毒力相关通路），也解释了为何缺失hupA不影响其他QS控制的毒力因子（如蛋白酶和鼠李糖脂）的产生。PYO的产生主要受Rhl和Pqs系统调节，而蛋白酶和鼠李糖脂的产生分别主要受Las和Rhl系统而非Pqs系统调节。

HU是细菌中最丰富、最保守的NAP之一。尽管它是各种生理过程（如DNA压缩、复制、转录、重组和形态调节）所必需的重要蛋白，但它通常以序列非特异性方式结合DNA，并在DNA损伤时对异常DNA结构具有高亲和力。HU蛋白调节细菌毒力的功能在几个细菌物种中已有报道，但详细的调节机制仍不清楚。由于其DNA结合能力，研究发现HU蛋白可以结合双链DNA以保护其免受氧化应激，从而提高土拉弗朗西斯菌的毒力。有趣的是，也有报道称HU蛋白可特异性结合靶基因启动子。例如，在阴沟肠杆菌中报道了HU蛋白与VI型分泌系统基因启动子的直接结合。本研究中，EMSA显示的HupA与pqs和phz启动子的直接结合，进一步强调了HU亚基作为序列特异性转录激活因子的作用，这一功能不同于HU蛋白典型的非特异性DNA结合活性。这种双重功能使HupA成为连接基因组结构和精确基因调控的独特角色。然而，HupA如何与HupB相互作用以调节PYO产生的机制仍不清楚。HupB和HU复合体在铜绿假单胞菌中的生理功能也值得进一步研究。

总而言之，本研究揭示了PA5348（HupA）是铜绿假单胞菌中控制QS活性和毒力基因表达的新型调节因子。通过阐明其通过特异性激活pqs和phz基因对PYO产生的正向调节，我们为HU蛋白α亚基在直接调节靶基因转录方面的功能提供了新的见解。