基于优化小麦胚无细胞系统合成及血管内皮生长因子生物活性表征

《Current Issues in Molecular Biology》：Synthesis and Biological Activity Characterization of Vascular Endothelial Growth Factor Using an Optimized Wheat Germ Cell-Free System Ming Liu, Ran Xiao, Chuiyang Kong, Aimei Liao, Long Pan and Jihong Huang

本文介绍了研究者通过构建包含腺苷激酶(AK)、腺苷酸激酶(ADK)和乙酰激酶(ACK)的三酶级联工程菌株，创建了一种自我更新的ATP再生源，并与优化的小麦胚提取物(WGE)无细胞合成平台整合，实现了包括血管内皮生长因子(VEGF165)在内的功能性真核蛋白的高效生产。研究表明，该系统可显著促进血管生成和细胞迁移，在再生医学领域具有应用潜力。

　　

构建工程ATP再生模块

为了克服无细胞蛋白合成系统普遍存在的能量限制，本研究通过代谢工程手段构建了一个能够自我更新ATP的能量源。研究者设计并合成了一个异源三酶级联系统，包括腺苷激酶(AK)、腺苷酸激酶(ADK)和乙酰激酶(ACK)。该酶级联能够有效地将低成本前体物质腺苷和乙酰磷酸(ACP)转化为ATP。首先，研究者将这三个酶的编码基因经过密码子优化，并构建了两种串联表达质粒pET28a-aadck和pET28a-AADCK。其中，pET28a-AADCK质粒利用内部核糖体进入位点(IRES)和P2A肽元件实现了在大肠杆菌BL21(DE3)中的共表达，SDS-PAGE和Western blot分析证实了AK、ADK和ACK融合蛋白的成功表达。

接下来，研究者对以工程菌为全细胞生物催化剂进行ATP生产的反应条件进行了系统优化。他们评估了反应时间、温度、ACP浓度、Mg²⁺浓度、细胞密度和pH值等六个关键参数的影响。结果表明，在最佳条件（35°C， 140 mM ACP， 16 mM Mg²⁺， 8 g/L细胞， pH 7.5，反应3.5小时）下，ATP产量最高可达约8 mM。这个高效的ATP再生模块旨在为下游的无细胞合成系统提供稳定、经济的能量供应。

建立并优化小麦胚无细胞蛋白合成平台

基于小麦胚提取物的无细胞蛋白合成系统因其在翻译和折叠复杂真核蛋白方面的高效性而被选用。研究者首先成功制备了小麦胚提取物，并建立了一个双层反应体系用于细胞内的翻译。为了验证该平台的普适性，他们成功表达了六种重组蛋白，包括荧光蛋白(sfGFP和mCherry)和几种血红蛋白类似物，通过Western blot和激光共聚焦显微镜证实了这些蛋白的正确表达和功能。

随后，为了最大化蛋白产量，研究者以sfGFP为报告蛋白，对该WGE-CFPS系统的关键参数进行了系统性优化。优化的参数包括WGE浓度、肌酸激酶(CrK)浓度、钾离子(K⁺)浓度、镁离子(Mg²⁺)浓度、磷酸肌酸(Cr)浓度和氨基酸浓度。最终确定了最佳反应条件为：60% (v/v) WGE， 0.5 mg/mL CrK， 200 mM K⁺， 3 mM Mg²⁺， 0.6 mM氨基酸混合物， 4 mM Cr。该优化平台为后续功能性蛋白的高效生产奠定了基础。

合成并验证血管内皮生长因子的生物活性

为了评估优化后系统的蛋白质表达能力，研究者选择人血管内皮生长因子165(VEGF₁₆₅)作为模型治疗性蛋白进行表达。VEGF₁₆₅是一种通过二硫键连接的同源二聚体蛋白，是调控血管生成的关键信号分子。在表达过程中，为了确保二硫键的正确形成，研究者在翻译混合物中省略了还原剂二硫苏糖醇(DTT)，并添加了蛋白质二硫键异构酶(PDI)。通过PCR、体外转录(IVT)和Western blot，研究者成功在优化后的CFPS平台中合成了VEGF₁₆₅。

接下来，研究者对细胞合成的VEGF₁₆₅进行了全面的生物活性验证。细胞毒性试验表明，纯化后的VEGF₁₆₅对人脐静脉内皮细胞和人皮肤成纤维细胞无毒性作用。细胞增殖实验（CCK-8法和EdU掺入法）显示，VEGF₁₆₅能显著促进这两种细胞的增殖。划痕愈合实验和Transwell迁移实验进一步证明，VEGF₁₆₅能有效加速HUVEC和HSF细胞的迁移，这对于伤口愈合和组织修复至关重要。

证实血管内皮生长因子的促血管生成功能

除了促进增殖和迁移，VEGF最核心的功能之一是诱导血管生成。研究者通过体外Matrigel基质胶试管形成实验评估了VEGF₁₆₅的促血管生成活性。实验结果显示，与PBS对照组相比，用纯化的VEGF₁₆₅处理的HUVEC细胞形成了更密集、相互连接且结构复杂的毛细血管样网状结构。通过对总管长和分支点数的定量分析，证实VEGF₁₆₅处理显著增加了血管网络的复杂程度。这些结果综合表明，通过本研究的优化CFPS平台合成的VEGF₁₆₅具有完全的生物活性，能够有效刺激内皮细胞的增殖、迁移和成管，在血管生成和组织修复中发挥关键作用。

研究意义与平台价值

本研究成功地将代谢工程与无细胞合成技术相结合，建立了一个高效、可扩展的ATP再生与真核蛋白生产整合平台。所构建的工程化大肠杆菌全细胞催化剂能够持续提供ATP，有效解决了CFPS中的能量限制问题。与之耦合的、经过参数优化的WGE-CFPS系统则能够高效生产结构正确、功能完整的真核蛋白。以VEGF₁₆₅为模型蛋白的成功表达和功能验证，充分证明了该平台在按需生产生物活性蛋白方面的巨大潜力。这项工作不仅为功能性真核蛋白的快速原型制作和高通量生产提供了新工具，也为推进再生医学、疾病模型构建及相关治疗应用奠定了坚实的技术基础。