《Current Issues in Molecular Biology》：MSTN and TCF12 as Candidate Immunometabolic Signatures in Glioma-Associated Foam Cells: Insights from Integrated Multi-Omics Analysis
Xu Liu,
Zhuo Song,
Zhijia Sun,
Chen Liu,
Xiaoli Kang,
Huilian Qiao,
Xinzhuo Tu,
Teng Li,
Zhiguang Fu and
Yingjie Wang
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本综述通过对单细胞和空间转录组数据的整合分析，系统解析了胶质瘤肿瘤微环境(TME)的细胞异质性，鉴定出肿瘤相关泡沫细胞(TAFCs)为中枢性细胞亚群，并揭示其标志基因MSTN与TCF12是关联巨噬细胞介导的免疫抑制和代谢重编程的候选免疫代谢特征，为患者风险分层和免疫代谢治疗提供了潜在生物标志物与靶点。
本研究采用整合多组学策略，旨在系统解析胶质瘤肿瘤微环境的细胞异质性、空间结构及免疫代谢特征。通过整合分析来自11个胶质瘤样本的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据与2个样本的空间转录组学(ST)数据，研究团队成功解构了胶质瘤微环境的细胞组成。分析揭示了肿瘤相关泡沫细胞(TAFCs)是该微环境中数量最丰富且处于细胞间通讯网络中心位置的细胞亚型。TAFCs在空间上主要定位于肿瘤富集区域，并且细胞通讯分析显示TAFCs与其他微环境细胞类型具有最广泛的相互作用网络，确立了其作为TME中通信枢纽的核心地位。
为了探究TAFCs的潜在功能角色，研究聚焦于其特异性标志基因。通过对TAFCs的标记基因进行随机生存森林(RSF)分析，筛选出三个具有高相对重要性分数(>0.4)的基因：肌生成抑制素/生长分化因子8(MSTN/GDF-8)、转录因子12(TCF12)和RPL3。进一步的生存分析证实，MSTN或TCF12的高表达与胶质瘤患者较差的总生存期(OS)显著相关，而RPL3则无此预后关联。因此，MSTN和TCF12被选定为核心特征基因进行深入研究。单变量和多变量Cox回归模型分析均确认，在调整性别和年龄后，MSTN和TCF12的高表达均是胶质瘤独立的、不良的预后因素，其中TCF12显示出更大的预后价值。
研究进一步分析了这两个特征基因与免疫微环境的关联。利用CIBERSORT算法对22种免疫浸润细胞的分析显示，肿瘤样本中存在独特的免疫细胞浸润模式，例如M2型巨噬细胞和中性粒细胞增加。相关性分析表明，MSTN和TCF12的表达均与M2型巨噬细胞浸润呈正相关。此外，MSTN的表达还与γδ T细胞正相关，与M0型巨噬细胞和调节性T细胞(Tregs)负相关；TCF12则与静息肥大细胞正相关，与活化肥大细胞和单核细胞负相关。这些发现提示MSTN和TCF12可能通过影响免疫细胞招募和功能极化，特别是促进M2型巨噬细胞表型，从而参与塑造胶质瘤的免疫抑制微环境。
在功能层面，研究探索了MSTN和TCF12与胶质瘤相关基因的共表达网络及其涉及的生物学通路。单细胞共表达网络分析揭示了这两个基因与胶质瘤相关基因（如H3-3A、FGFR1）之间存在潜在的调控相互作用。通路活性分析(AUCell)显示，高表达MSTN或TCF12的细胞在免疫代谢通路，如胆固醇稳态、雄激素反应和血管生成中表现出更高的活性评分。然而，当基于免疫浸润评分对细胞分层时，高表达组显示出脂质代谢特征活性的降低，这表明脂质代谢重塑与这些基因在胶质瘤微环境中的免疫调节功能相关联。
为了深入理解MSTN和TCF12的调控机制，研究进行了转录因子(TF)和微小RNA(miRNA)调控网络预测。通过RcisTarget进行的转录因子基序富集分析发现，与MSTN和TCF12相关的基因集启动子区存在多个显著富集的TF基序。同时，利用MiRcode数据库反向预测，鉴定出63个可能与MSTN或TCF12相互作用的潜在miRNA，构成了包含82个预测的mRNA-miRNA调控对，如miR-129-5p、miR-219-5p和miR-221，提示了转录后调控的可能性。基因集富集分析(GSEA)和基因集变异分析(GSVA)进一步阐明了它们参与的关键生物学过程。MSTN显著富集于核糖体、氧化磷酸化和范可尼贫血通路，而TCF12则富集于mRNA监测、Notch信号通路和范可尼贫血通路。GSVA分析也凸显了它们不同的功能谱：MSTN与DNA修复和精子发生通路相关，TCF12则与G2/M检查点和E2F靶标通路密切相关。这些结果暗示MSTN和TCF12可能通过调控细胞周期进程、DNA修复和代谢等基本过程，共同促进胶质瘤进展并塑造TME的免疫功能景观。
研究还通过空间转录组学数据揭示了MSTN和TCF12的表达在胶质瘤组织内具有显著的空间异质性，在肿瘤核心、侵袭边缘和邻近非肿瘤区域呈现梯度变化。整合scRNA-seq和ST数据的拟时序分析重建了细胞分化轨迹，并量化了MSTN和TCF12沿拟时序轴在九种注释细胞类型中的动态表达模式，显示二者具有清晰的、细胞类型依赖性的表达规律，表明它们可能参与胶质瘤进展过程中的细胞状态转换和组织结构调控。
在转化医学价值方面，研究利用GDSC数据库和“oncoPredict”R包评估了MSTN和TCF12表达与化疗敏感性的关联。分析预测，MSTN的表达与紫杉醇和VE-822的敏感性显著相关。TCF12的表达则与阿糖胞苷、奥拉帕利、Wee1抑制剂、紫杉醇和VE-822的敏感性存在潜在关联。这些发现为基于基因表达的个体化化疗策略提供了线索。此外，通过逻辑回归分析结合临床参数与MSTN、TCF12表达构建的诺莫图模型，能够有效实现胶质瘤的风险分层，更高的综合评分预示着更差的2年和3年生存结局。校准曲线显示诺莫图预测的总体生存概率与实际观察结果具有高度一致性。决策曲线分析进一步表明，整合了MSTN和TCF12的组合模型在0.3-0.7的风险阈值范围内显示出最大的临床净收益。
最后，研究通过免疫荧光染色在独立临床样本中进行了实验验证。苏木精-伊红(HE)染色显示，肿瘤区域富含泡沫样细胞，而相邻非肿瘤组织则含有大量小胶质细胞。免疫荧光分析证实，与癌旁组织相比，MSTN和TCF12在胶质瘤组织中的表达均显著上调。通过使用巨噬细胞标志物CD163与MSTN或TCF12进行双色共染色，发现在肿瘤区域内，共表达CD163与MSTN或TCF12的巨噬细胞比例显著增加。这从组织学和蛋白质水平验证了MSTN和TCF12在TAFC富集区域表达升高，并与肿瘤相关巨噬细胞共定位，支持了它们在胶质瘤微环境中介导巨噬细胞依赖性免疫重塑的潜在作用。
综上所述，这项整合多组学研究将TAFCs鉴定为胶质瘤肿瘤微环境中数量最多、连接最广泛的核心细胞亚群，并确定MSTN和TCF12是驱动免疫抑制微环境形成和代谢重编程的关键TAFCs核心基因，从而促进胶质瘤进展和不良预后。研究通过单细胞解卷积、空间转录组学和大体积RNA-seq数据的生物信息学分析，系统阐述了这些特征基因与M2型巨噬细胞极化、中性粒细胞招募、免疫检查点分子、化疗敏感性及多层调控网络之间的关系。构建的整合临床信息和TAFC特征基因的预后诺莫图能够准确预测患者生存和治疗反应。因此，这项研究为理解胶质瘤微环境中TAMs的空间异质性提供了新视角，MSTN和TCF12有望成为具有潜在可操作性分子机制的生物标志物。
