《Insects》：A New Approach Integrating Brood-Associated Semiochemicals with Additional Feeding for Honey Bee (Apis mellifera) Colony Development
Irina Ciotlaus,
Ana Balea,
Diana Klara Gaia and
Maria Pojar-Fenesan
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本文亮点推荐：本研究在意大利蜜蜂幼虫中鉴定出一种新型微小RNA（miRNA） novel-m0027-3p，证实其可直接靶向并负调控保幼激素（JH）合成的关键酶基因JHAMT，从而调控幼虫体内JH滴度及下游基因AmHex70b、AmKr-h1的表达，为阐明miRNA如何通过激素通路影响蜜蜂发育提供了直接证据。
一种新型微小RNA调控蜜蜂幼虫激素合成与发育的机制探究
引言
微小RNA（miRNAs）是一类在真核生物中广泛存在的内源性非编码RNA，长度约为18-25个核苷酸。它们通过特异性结合靶信使RNA（mRNA）的3'非翻译区（3' UTR）或编码序列，在转录后水平调控基因的表达，从而参与生物体的发育、免疫反应等多种生物学过程。在昆虫中，miRNAs对生长、发育、繁殖和代谢起着至关重要的调节作用。
保幼激素（JH）是调控昆虫幼虫发育的关键激素之一。在蜜蜂中，JH对于幼虫的发育和级型分化具有决定性作用。保幼激素酸甲基转移酶（JHAMT）是JH生物合成途径中的限速酶，催化JH合成的最后一步反应。已有研究表明，在其他昆虫物种中，miRNAs可以通过调控JHAMT的表达来影响JH的合成。然而，关于miRNAs如何通过调控JHAMT来影响蜜蜂幼虫JH合成与发育的机制，研究尚不充分。基于此，本研究旨在探究一种在蜜蜂幼虫肠道中发现的新型miRNA novel-m0027-3p，是否通过靶向调控AmJhamt基因，进而影响意大利蜜蜂幼虫的JH合成与下游信号通路。
研究材料与方法
本研究以意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）为研究对象。采用人工饲料饲喂法，在恒温恒湿（35±0.5°C，相对湿度90%，黑暗条件）环境下培养2日龄幼虫。通过以下实验方法系统探究了novel-m0027-3p的功能：
- 1.
表达谱分析：利用茎环RT-PCR和qPCR技术，检测了novel-m0027-3p在幼虫、预蛹及蛹等八个不同发育阶段的表达动态。
- 2.
靶基因预测与功能富集：结合RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测novel-m0027-3p的靶基因，并通过GO和KEGG数据库对预测的靶基因进行功能注释，重点关注与激素合成相关的通路。
- 3.
靶向关系验证：
- •
使用双荧光素酶报告基因实验，验证novel-m0027-3p与AmJhamt基因3' UTR区域的直接结合关系。实验构建了包含预测结合位点的野生型（AmJhamt-wt）和突变型（AmJhamt-mut）报告质粒。
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通过给3日龄幼虫饲喂novel-m0027-3p的模拟物（Mimics）或抑制剂（Inhibitors），在体内上调和下调novel-m0027-3p的表达，随后利用qPCR检测幼虫中AmJhamt基因的表达变化。
- 4.
对激素信号通路的影响评估：在饲喂Mimics或Inhibitors后，通过酶联免疫吸附测定法检测幼虫体内JH滴度的变化。同时，通过qPCR检测JH信号通路下游关键基因——保幼激素载体蛋白Hexamerin 70b（AmHex70b）和转录因子Krüppel homolog 1（AmKr-h1）的表达水平。
- 5.
对幼虫体重的影响：测量了经不同处理（Mimics, Inhibitors）后4至6日龄幼虫的体重变化。
研究结果
1. novel-m0027-3p的鉴定、表达模式及其靶基因分析
通过茎环RT-PCR证实，novel-m0027-3p在蜜蜂从幼虫到蛹的所有被检阶段均有表达。其表达水平在6日龄幼虫中最高，在4日龄幼虫中最低。在蛹期，其表达量先升高后逐渐降低。这表明novel-m0027-3p可能在幼虫期及幼虫-蛹变态转换过程中发挥重要作用。
靶基因预测分析发现，novel-m0027-3p可能靶向2109个mRNA。通过GO和KEGG富集分析，从与激素合成或分泌相关的通路中筛选出6个潜在的激素通路相关靶基因，其中Jhamt（AmJhamt）是JH合成中的关键限速酶基因。
2. novel-m0027-3p负调控靶基因AmJhamt的表达
生物信息学预测显示，novel-m0027-3p与AmJhamt 3' UTR区域的结合自由能为-51.46 kJ/mol。双荧光素酶报告基因实验证实，过表达novel-m0027-3p可显著抑制包含野生型结合位点的报告基因活性，而当结合位点发生突变时，这种抑制效应消失。这直接证明了novel-m0027-3p能与AmJhamt特异性结合。
体内功能实验进一步验证了这种调控关系。在饲喂Mimics以过表达novel-m0027-3p后，4至6日龄幼虫体内novel-m0027-3p表达量显著上调，而其靶基因AmJhamt的表达量则显著下调。相反，饲喂Inhibitors以敲低novel-m0027-3p后，其表达量下降，而AmJhamt的表达量在4日和6日龄幼虫中显著上调。这些结果一致表明，novel-m0027-3p在体内能负调控AmJhamt基因的表达。
3. novel-m0027-3p对激素信号通路及幼虫体重的影响
对激素水平的检测发现，过表达novel-m0027-3p导致4至6日龄幼虫体内的JH滴度显著降低。与此同时，JH信号通路下游基因AmHex70b和AmKr-h1的表达也受到显著抑制。反之，敲低novel-m0027-3p则导致了幼虫JH滴度的显著升高，并伴随着AmHex70b和AmKr-h1表达水平的上调。这些数据表明，novel-m0027-3p通过调控AmJhamt，影响了JH的生物合成，进而改变了整个JH信号通路的活性。
尽管novel-m0027-3p显著影响了JH信号，但其对幼虫体重的影响相对有限。过表达novel-m0027-3p仅导致5日龄幼虫体重显著下降，而敲低后仅在4日龄幼虫中观察到了体重显著增加。这表明novel-m0027-3p主要通过调控激素通路影响发育进程，而对幼虫生长指标的直接影响较小。
讨论
本研究首次在意大利蜜蜂中揭示，新型微小RNA novel-m0027-3p通过直接靶向并负调控保幼激素酸甲基转移酶基因AmJhamt，进而影响幼虫体内JH的生物合成及下游信号通路。这一发现为理解miRNAs如何精细调控社会性昆虫的激素通路和发育过程提供了新的实验证据。
JHAMT是JH合成途径中的限速酶，在蜜蜂幼虫发育和级型分化中扮演着“开关”角色。我们的研究表明，novel-m0027-3p在6日龄幼虫中表达最高，而4-6日龄正是蜜蜂幼虫对JH最敏感、决定其未来是发育为工蜂还是蜂王的关键时期。novel-m0027-3p在这一时期对AmJhamt的强效抑制，可能是一种精密的发育计时机制。这一机制与先前在其他昆虫（如飞蝗、果蝇、草地贪夜蛾）中发现miRNAs调控Jhamt的现象相呼应，揭示了不同物种间保守的调控策略。
值得注意的是，虽然novel-m0027-3p显著改变了JH滴度及下游基因表达，但对幼虫体重的调控作用有限。这可能是因为幼虫的体重增长受多因素调控，novel-m0027-3p除AmJhamt外，还预测靶向AmE75、AmUsp等其他激素通路相关基因，其综合效应更为复杂。此外，研究也发现，不同的对照组间JH滴度存在差异，这提示实验室微环境（如温湿度）的细微变化也可能影响幼虫的生理状态，是未来实验设计中需控制的重要变量。
结论
综上所述，本研究证实，在意大利蜜蜂幼虫中，新型微小RNA novel-m0027-3p能够特异性结合并负调控保幼激素合成关键基因AmJhamt的表达，从而降低幼虫体内的保幼激素水平，并抑制下游JH响应基因AmHex70b和AmKr-h1的表达。这一发现不仅丰富了我们对蜜蜂发育调控分子网络的认识，也为探索通过非编码RNA途径调控社会性昆虫发育和级型分化提供了新的潜在靶点。未来的研究可进一步探究novel-m0027-3p其他预测靶基因（如AmE75、AmUsp）的功能，以更全面地解析其在蜜蜂发育调控网络中的作用。
