《Beverages》：Utilizing Hydrolyzed Whey Proteins in a Flavored Dairy Beverage for Carrier Antihypertensive Peptides
Luis Guillermo González Olivares,
Elizabeth Contreras López,
Nayeli Vélez Rivera,
Ilse Monroy Rodríguez and
Juan Ramírez Godínez
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本文研究了利用胰酶水解乳清释放生物活性肽，并将其作为功能性成分添加至风味乳饮料中。研究评估了其体外血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性，发现虽然饮料中的活性低于纯水解物，但证明了乳饮料作为生物活性肽载体的潜力，为开发具有辅助降压功能的乳制品提供了新思路。
引言
乳清作为一种重要的蛋白质来源和膳食补充剂，因其富含必需氨基酸而长期受到重视。除了营养价值，乳清蛋白还具有广泛的生物活性，包括预防特定癌症，以及抗病毒、抗菌和免疫调节等特性。乳清蛋白在调节食欲、增加饱腹感和体重管理方面也显示出潜在益处。这些多方面的生物活性使其成为开发具有靶向治疗功效的功能性食品的宝贵原料。
其中，乳铁蛋白是乳清中最具生物活性的蛋白质之一，它对包括与胃溃疡相关的幽门螺杆菌在内的多种微生物具有抑菌特性。此外，当乳清被用作发酵培养基时，乳酸菌会水解乳清蛋白，释放出具有多种有益特性的生物活性肽。生物活性肽是短链蛋白片段，通常由2至15个氨基酸残基组成，它们在完整的蛋白质中是无活性的，但可以在消化过程中或通过酶解过程释放出来。这些肽表现出多种生物活性，包括抗菌、抗高血压、抗氧化、免疫调节和阿片样效应。在具有抗高血压特性的肽中，乳激肽尤为突出。这些肽来源于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白蛋白，以其抑制血管紧张素转换酶的能力而闻名。ACE抑制是降低血压的一种成熟机制，使得乳激肽成为有前景的抗高血压剂候选物。
使用源自乳酸菌或真菌的微生物蛋白酶是生产具有抗高血压活性肽的一种有前途的方法，因为它能有效释放这些生物活性化合物。此外，源自乳清蛋白的分子量低于3 kDa的肽在开发用于控制高血压的功能性产品方面，对食品和制药行业具有重要潜力。本研究提出了一种胰酶在乳清蛋白酶解中的新应用。与其他常用酶或发酵过程不同，胰酶能够释放具有抗高血压潜力的低分子量肽。在此基础上，该研究旨在利用水解乳清的营养和生物活性价值，开发一种能够天然管理高血压的功能性饮料。
材料与方法
酶解使用来自猪胰腺的胰酶进行。将巴氏杀菌的10%乳清溶液在缓冲液中制备。酶以100:5的蛋白/酶比例添加。水解在37°C、恒定pH 6.0条件下进行7小时。每30分钟取样一次，并通过加热灭活酶。通过三硝基苯磺酸法测定蛋白水解度。通过Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析低分子量肽。通过分光光度法测定血管紧张素转换酶抑制活性，并根据公式计算抑制率。
将水解乳清应用于风味饮料中，其配方如表1所示。饮料的制备分为两部分：首先是水相和油相的制备，其次是相的混合。将20克水解乳清溶解于水中，添加酶溶液，并在37°C孵育3.5小时和7小时。制备了三种不同的饮料，分别使用水解3.5小时和7小时的乳清，以及一种使用未水解乳清溶液的饮料。水解后，向混合物中添加盐和糖，并使用涡轮搅拌机搅拌。接下来，加入脱脂奶粉和果葡糖浆，并继续搅拌。同时，将无水乳脂融化，并将稳定剂加入融化的脂肪中，然后使用不锈钢打蛋器进行均质。在搅拌下将水相逐渐加入油相中，加入剩余的水，并将混合物加热至70°C。使用涡轮搅拌机进行高速混合以实现完全均质。最后，用菠萝椰子风味剂调味，并在80°C下于开放锅中巴氏杀菌15分钟，以确保微生物安全性和稳定性。
结果与讨论
水解过程分析
在7小时的水解过程中，游离氨基浓度从初始的158.66 mg/L显著增加至298.41 mg/L。这一增加表明游离氨基的逐步释放，反映了酶水解的有效性。最高浓度出现在5.5小时，此后保持稳定。该结果与之前的研究报告一致，表明胰酶能够有效水解蛋白质并释放氨基酸，且没有酶饱和的迹象。然而，这并不一定意味着在释放生物活性肽方面达到了最优效率或特异性。胰酶已被证明能产生具有抗高血压、抗氧化和其他健康促进特性的生物活性肽，证实了其在获取用于食品和制药行业的功能性化合物方面的实用性。
水解产物的SDS-PAGE分离分析
电泳分析显示了水解初始数小时内蛋白质的逐步水解模式。酪蛋白残基在前4小时内完全消失。同时，在T1和T2之间，观察到分子量低于10 kDa和6.5 kDa的肽明显积累，表明乳清蛋白是主要底物，随着水解进行产生更小的肽。蛋白质A和B的显著减少证实了它们转化为低分子量肽组分。蛋白质的逐步分解和低分子量肽的释放证实了胰酶在水解过程中的催化效率。小于6.5 kDa的肽因其报道的生物活性特性（尤其是抗高血压作用）而特别重要。与先前发现一致，胰酶可产生具有抗氧化和抗高血压潜力的生物活性肽，水解过程中低于6.5 kDa的肽积累支持了它们在ACE抑制和血压调节中的可能作用。
然而，分子大小本身并不确保生物活性；这在很大程度上取决于氨基酸组成和序列，特别是C端是否存在脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸等疏水性残基，这些残基可增强与ACE活性位点的相互作用。与其他蛋白酶相比，胰酶具有广泛的水解谱，但比胰蛋白酶、碱性蛋白酶或胃蛋白酶等酶的特异性低，这可能解释了更异质的肽谱的形成，从而导致高活性抗高血压序列的比例较小。从技术角度来看，胰酶具有实际优势——它是一种食品级、低成本的酶，在温和的pH和温度条件下操作——但其低催化特异性可能限制生物活性序列的选择性富集。
水解乳清的抗高血压活性测定
抗高血压活性通常在水解乳清蛋白的短时间内观察到，这主要归因于低分子量肽的释放。例如，从β-乳球蛋白蛋白中鉴定出两种ACE抑制肽，即使经过消化，这些肽仍能保持其抗高血压活性。这突显了乳清水解，特别是使用特异性蛋白酶时，在产生可用于开发功能性食品或营养品以控制高血压的生物活性肽方面的潜力。
水解7小时后，ACE抑制能力达到42.97 ± 3.38%，与3.5小时观察到的19.53 ± 5.52%相比显著增加。活性的增加表明，随着水解的进行，更多的生物活性肽被释放出来，有助于抑制血管紧张素转换酶。尽管7小时观察到的42%的ACE抑制率与乳清来源肽的报告范围一致，但有研究报告使用风味酶和碱性蛋白酶水解乳清的抑制水平接近70%。这种差异凸显了当前水解策略的潜在局限性，可能是由于酶特异性欠佳、反应条件不充分或所生成肽的生物活性有限。因此，仅依赖乳清作为底物和胰酶作为催化剂可能不足以实现实际抗高血压功能所需的高生物活性水平。
本研究与先前研究中观察到的抑制活性差异可归因于用于肽释放的方法。先前关于乳清来源的抗高血压肽的体外研究主要集中在使用商业蛋白酶的酶解和模拟胃肠道消化模型。这些方法旨在模拟生理条件并增强肽的释放和生物活性。特别是，微生物蛋白酶和胃肠道酶的联合或顺序作用已被证明能产生具有增强抗高血压潜力的肽。单独使用胰酶可能限制了肽的多样性和ACE抑制活性。观察到的较低抑制表明，使用更复杂的水解方法可以提高从乳清蛋白中生产抗高血压肽的效率。
水解乳清在乳饮料中的应用及抗高血压能力
为了评估水解乳清的功能性是否在终产品中得以保留，对配制的乳饮料进行了SDS-PAGE分析，以确定低分子量肽的浓度。对用胰酶水解7小时的乳清制成的乳饮料的电泳凝胶分析用于检测和定量分子量低于2 kDa的肽。饮料的分析显示大量存在低于2 kDa的肽，与水解乳清中发现的类似。重要的是，这类肽在未水解乳清中不存在，突出了酶解在其形成中的核心作用。
在用水解乳清配制的饮料中，低分子量肽的逐步保留反映了水解过程中高分子量蛋白质的有效酶解，因为胰酶促进了较小肽组分随时间的受控释放。虽然工业乳清粉生产中涉及的高温过程可能诱发偶然的蛋白质水解并产生小肽，但这些热衍生肽的功能相关性仍不确定，因为肽的生物活性在很大程度上取决于水解程度和加工条件。因此，区分饮料基质中保留的酶解生成肽与热处理过程中形成的肽，对于准确归因其生物功能特性至关重要。
关于抗高血压能力，观察到的ACE抑制率为11.88 ± 0.26%，低于预期。通常，源自乳清的肽表现出30%或更高的ACE抑制值。因此，这个结果有些令人惊讶。一些研究表明，当功能性饮料中乳清浓度达到5 mg/mL时，ACE抑制值可接近70%。一个重要方面是，尽管本研究的饮料表现出相对较低的抗高血压活性，但当水解乳清被纳入乳基质时，特别是在体外蛋白酶消化后，已有报告称出现类似的活性降低。这种反复出现的结果表明，乳基质中的特定成分可能会干扰抗高血压肽的表达或稳定性。尽管如此，有证据表明，其他功能特性，如抗氧化活性，受这些相互作用的影响可能较小，可以得以保留。这些发现表明，即使观察到的生物活性百分比很低，配制的饮料仍可有效地作为乳清来源的生物活性肽的载体。在本研究中，饮料基质实现了具有抗高血压潜力的肽的掺入和保留，支持了其作为递送系统的作用，而不仅仅是生物活性增强剂。
饮料最终的ACE抑制值11.88%与纯水解物中观察到的42%相比显著降低。这种降低可归因于乳基质内多种物理化学相互作用，限制了肽的可用性和稳定性。首先，酪蛋白胶束和未水解的乳清蛋白可与生物活性肽形成非共价复合物，从而降低它们对ACE催化位点的可及性。此外，还原糖和磷酸盐的存在可能会诱导糖基化或热聚集反应，特别是在巴氏杀菌过程中，改变肽的构象并削弱其与酶结合的能力。诸如pH、离子强度和热处理条件等参数在维持肽在饮料系统中的功能完整性方面起着至关重要的作用。最后，较低的体外ACE抑制并不一定表示体内功效降低，因为一些肽在胃肠道消化或肠道转运后仍保留甚至获得功能性。因此，结合动力学分析、结构建模和模拟消化实验，可以更深入地了解所产生的抗高血压肽的稳定性和真实生物利用度。
局限性
本研究有几个局限性。抗高血压活性仅通过体外ACE抑制试验进行评估，不能完全反映生理条件下肽的生物利用度、稳定性或功效。酶解采用胰酶作为单酶系统并在固定反应条件下进行，与功能性食品研究中常用的多酶或基于发酵的方法相比，可能限制了肽的多样性和特异性。此外，乳饮料的配方和加工条件，包括巴氏杀菌和与其他基质成分的相互作用，可能影响了肽的稳定性和可测量的ACE抑制，从而限制了研究结果对其他配方的适用性。缺乏感官评价、货架期研究和消费者测试也限制了关于产品接受度和实际应用的结论。尽管如此，该研究为使用胰酶水解乳清作为功能性成分提供了有价值的初步见解，并强调了在未来研究中应解决的关键因素，以增强其适用性和转化相关性。
结论
使用胰酶水解乳清蛋白产生低分子量肽，这与所得风味乳饮料的抗高血压潜力密切相关。此外，观察到的约42%的抑制率与最终制备产品之间的差异也可能是因为水解乳清蛋白只是整个配方中的一种成分。它们与基质中其他成分的相互作用可能会降低可测量的活性，这凸显了食品系统对抗高血压肽的生物利用度和表达的影响。风味乳饮料的其他成分，包括基础原料，可能通过干扰肽的生物活性并限制ACE抑制而减弱了抗高血压活性，尽管存在低分子量肽。尽管如此，即使抗高血压活性低于文献报告，饮料基质仍有效地作为具有抗高血压潜力的乳清来源肽的载体，实现了它们的掺入和保留。这支持了乳清作为一种功能性成分的作用，具有超越ACE抑制的生物活性，如抗氧化和抗炎作用。因此，需要进一步研究来优化抗高血压饮料配方，通过平衡酶解条件和基质组成，在确保感官可接受性的同时保留肽的功能性。由于本研究未涉及感官评价和质量控制，未来的工作应聚焦于这些方面，以评估消费者接受度和产品稳定性。
