《Fishes》：Acute Hypoxia Stress in the Mudskipper (Boleophthalmus pectinirostris): Effects of Puerarin and Dexamethasone
Dexiang Feng,
Qianqian Huang,
Guangjun Wang,
Xuyuan Shao and
Zhifei Li
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本研究探讨了葛根素与地塞米松对弹涂鱼急性低氧应激的保护作用。研究表明，低氧压力会扰乱弹涂鱼肝脏中的氧稳态并诱导细胞凋亡，而外源性给予葛根素或地塞米松可通过调控Akt/GSK-3β、HIF-1α/VEGF及p53/BNIP3等信号通路，有效缓解低氧造成的不良生理影响，为水产养殖中应对低氧胁迫提供了潜在的分子干预策略。
1. 引言
水产养殖的集约化常常导致水体溶解氧耗竭，对水生生物构成显著的低氧胁迫。弹涂鱼由于其独特的穴居习性和潮间带环境，对低氧胁迫敏感，是研究低氧应激反应的理想模型。低氧条件下，鱼类会启动一系列代偿性调整，包括行为改变和代谢向无氧糖酵解转变。这一转变由乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸激酶(PK)等关键酶介导。然而，持续严重的低氧不可避免地会造成损伤。低氧应激激活由复杂且相互关联的信号网络介导的分子反应。其中，PI3K/Akt通路是参与细胞凋亡的主要通路之一。蛋白激酶B (PKB/Akt)是内源性通路的一部分，也是糖原合酶激酶-3β (GSK-3β)上游的关键蛋白；磷酸化的Akt会抑制GSK-3β的活性。GSK-3β参与多种通路，包括调节细胞周期、侵袭、细胞极化、凋亡和迁移。在低氧条件下，PI3K-Akt-GSK-3β信号通路可调节低氧诱导因子-1 (HIF-1α)的活性。HIF-1α是生理性低氧的核心调节因子，通过控制细胞生长和死亡介导对低氧胁迫的适应。在青鳉中，HIF-1信号通路通过调节低氧诱导基因，包括血管内皮生长因子(VEGF)、Bcl-2/腺病毒E1B 19kD相互作用蛋白3 (BNIP3)和肿瘤抑制蛋白p53，来促进低氧适应。然而，不同鱼类的低氧耐受性取决于其耐受能力，鱼类低氧应激所涉及的分子机制仍知之甚少。
葛根素可用于治疗心脑血管疾病，其化学本质是一种异黄酮。近期研究表明，葛根素可能对低氧和低压引起的炎症性疾病有治疗作用；它能明显预防大鼠因低压低氧条件引起的肺和脑损伤。葛根素在缺氧损伤中存在一种新的保护机制。在地塞米松方面，这种合成糖皮质激素的抗炎特性可用于治疗高原低氧引起的脑水肿，并已在临床成功应用。然而，葛根素和地塞米松对鱼类低氧应激的影响仍然知之甚少。本研究旨在探究急性低氧应激对弹涂鱼肝脏中Akt、GSK、LDH和PK活性，以及Akt、GSK-3β、HIF-1、BNIP3、VEGF和p53表达水平的影响，以及外源性葛根素和地塞米松的缓解作用。
2. 材料与方法
2.1. 模型选择与实验设计的依据
选择弹涂鱼作为实验模型，是因为其天生对低氧具有高耐受性，这一特性由其自然潮间带栖息地进化而来。这使其成为阐明鱼类低氧适应核心分子机制的敏感且信息丰富的模型。为了研究葛根素和地塞米松在调节这些机制中的具体作用，采用了腹腔注射途径。选择此方法是为了确保精确和一致的给药，从而能够清晰解读化合物对目标信号通路的影响。
2.2. 动物与实验设计
弹涂鱼在15‰盐度的海水中适应14天后，随机分配到12个300升的矩形塑料水箱中，每个水箱40尾鱼，设三个重复。设置四个实验组：对照组(HC)和低氧组(HH)的鱼腹腔注射氯化钠溶液，葛根素组(HP)腹腔注射葛根素，地塞米松组(HD)腹腔注射地塞米松。所有四组鱼每天腹腔注射一次，共三次。然后，HC组持续充气。另一方面，HH、HP和HD组接受低氧处理，通过向水中通入100%氮气将水溶解氧从常氧降至低氧水平。在试验期间，所有组弹涂鱼的存活率均达到100%。
2.3. 样品采集
在低氧处理期间，于0、24和48小时对实验鱼进行采样。快速取出肝脏和鳃组织，液氮速冻后储存于-80°C用于RNA提取。剩余的肝脏混合后储存于-20°C用于ELISA法检测蛋白。
2.4. 蛋白质含量分析
使用商业ELISA试剂盒定量肝脏中Akt、GSK、LDH和PK的蛋白浓度。
2.5. 总RNA提取、cDNA合成和实时定量PCR
使用RNAiso Plus从肝脏和鳃组织中分离总RNA。使用SYBR Premix Ex Taq在Roche LightCycler 480 II系统上进行实时定量PCR。使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量，以β-肌动蛋白作为内参基因进行标准化。
2.6. 统计分析
数据采用双向方差分析和Tukey多重比较检验进行处理。数据以平均值±标准差表示，显著性水平设定为p < 0.05。
3. 结果
双向方差分析结果显示，对于所有测量的肝脏参数，包括Akt、GSK-3β、LDH和PK的蛋白浓度，以及AKT、GSK-3β、HIF-1、VEGF、p53和BNIP3的mRNA表达水平，处理和时间的主效应均高度显著。重要的是，所有肝脏变量均检测到显著的处理与时间交互作用，表明低氧和药物处理对这些参数的影响随时间变化显著。在鳃组织中，基因表达分析得出了相似但不完全相同的模式。对于GSK-3β、HIF-1、VEGF、p53和BNIP3，双向方差分析显示处理和时间的主效应均高度显著，且存在显著的处理与时间交互作用。相反，对于鳃AKT mRNA表达，双向方差分析揭示了处理的显著主效应，但时间效应不显著，且处理与时间交互作用不显著。这表明，虽然处理条件影响了鳃Akt表达，但其表达水平在48小时实验期内保持稳定，且处理效应不随时间变化。
在0小时，所有组之间Akt、GSK、LDH和PK的蛋白含量无显著差异。在24小时，HH组鱼的肝脏Akt蛋白含量最低，其次是HD组鱼；HC和HP组的值最高。HC组鱼的肝脏GSK蛋白含量显著高于HH和HP组鱼；HD组的值显著最低。HH和HD组鱼的肝脏LDH和PK蛋白含量显著低于HC和HP组鱼。在48小时，HH组鱼的肝脏Akt含量仍为最低，最高值出现在HP组。在HD组，Akt蛋白含量恢复到正常水平。在HH组，肝脏GSK蛋白含量最低，其次是HD组鱼；除HC组外，HP组的GSK蛋白含量最高。HH和HD组肝脏的LDH和PK蛋白含量也显著低于其他两组。
在0小时，所有组肝脏GSK-3β、Akt、HIF-1、VEGF、p53和BNIP3的mRNA表达水平无显著差异。在24小时，GSK-3β的mRNA表达水平在HH组最低，在HC组最高；Akt的mRNA表达水平在HH和HP组最低，其次是HD组鱼；在HC组最高。p53的mRNA表达水平在HC组最低，在HH、HP和HD组之间无显著差异。BNIP3的mRNA表达水平在HH组最高，其次是HP和HD组；在HC组最低。HIF-1的mRNA表达水平在HP组最高，其次是HH和HD组；在HC组最低。VEGF的mRNA表达水平在HH组最高，在HC组最低。在48小时，GSK-3β的mRNA表达水平在HH组最低，HD组的mRNA表达水平低于HC和HP组，而HP和HC组之间无显著差异。Akt的mRNA表达水平在HH组最低，其次是HC和HD组鱼，最高值出现在HP组。p53和BNIP3的最高值出现在HH组。HIF-1的mRNA表达水平在HH组最高，其次是HC组，最低值出现在HP组；VEGF的mRNA表达水平在HH组最高，其次是HD组；最低值是HC和HP组。
在0小时，所有组鳃GSK-3β、Akt、HIF-1、VEGF、p53和BNIP3的mRNA表达水平无显著差异。在24小时，HC组GSK-3β的mRNA表达水平高于其他组，而所有组Akt水平无显著差异。p53的mRNA表达水平在HH组最高，其次是HD和HP组鱼；在HH组出现最低值。BNIP3的mRNA表达水平在HH组最高，在HH组出现最低值。HIF-1的mRNA表达水平在HC组最低。VEGF的mRNA表达水平在HD组最高，在HH、HP和HD组之间无显著差异。在48小时，GSK-3β的mRNA表达水平在HH组最低，其次是HP和HD组鱼。所有组Akt水平无显著差异。p53和BNIP3的mRNA表达水平在HH组最高，在HH组最低。HIF-1和VEGF的mRNA表达水平在HH组最高。
4. 讨论
Akt/GSK-3β信号通路在细胞应对低氧的反应中起着关键作用。在本研究中，急性低氧胁迫在24和48小时均降低了肝脏GSK和Akt的含量。这种抑制与人类肝癌细胞在严重低氧条件下Akt/GSK-3β信号同样被抑制的发现一致。本研究还发现，腹腔注射葛根素和地塞米松在48小时显著增加了Akt和GSK含量，但预处理葛根素仅在24小时增加了GSK含量，这表明葛根素和地塞米松都能减轻低氧应激对弹涂鱼生理的不良影响，但地塞米松缓解GSK含量水平的时间晚于葛根素，这表明地塞米松的缓解作用慢于葛根素，不能用作缓解急性低氧应激的缓解剂。本研究的一个局限性是使用ELISA测量了酶蛋白浓度，而非直接酶活性。虽然酶浓度的变化可以反映低氧胁迫下表达或周转的改变，但由于翻译后修饰、变构调节和其他细胞因素，它们不一定与催化活性相关。
在低氧应激下，鱼类依赖无氧糖酵解产生能量。在本研究中，HH组鱼在24和48小时表现出较低的肝脏LDH含量，证实了低氧暴露下LDH受到抑制。LDH含量降低可能是低氧条件下的一种保护机制，可以减轻丙酮酸转化为乳酸引起的细胞毒性。本研究发现，预处理葛根素可以在24和48小时将肝脏LDH含量恢复到正常水平，但地塞米松仅在48小时增加LDH含量，这表明预处理葛根素或地塞米松可以挽救低氧诱导的LDH含量紊乱，且葛根素的缓解作用明显优于地塞米松。丙酮酸激酶(PK)在无氧条件下介导葡萄糖向丙酮酸的转化。本研究显示肝脏PK含量在24和48小时降低，表明急性低氧胁迫通过减少肝脏中丙酮酸的生成来抑制三羧酸循环和糖酵解。本研究还发现，预处理葛根素在24小时增加了肝脏PK含量，但预处理地塞米松在48小时增加PK含量，这表明腹腔注射葛根素或地塞米松可以改善低氧诱导的PK含量减少；葛根素的缓解作用比地塞米松更有效。
GSK-3β是Akt的关键下游靶点，在低氧信号传导中至关重要。在本研究中，低氧胁迫在24和48小时显著降低了肝脏Akt和GSK-3β的mRNA水平，这表明在严重低氧胁迫情况下，肝脏中Akt/GSK-3β信号传导受到抑制。此外，低氧胁迫在24和48小时显著降低了鳃GSK-3β的mRNA水平，但Akt的mRNA水平在所有组间无显著变化，这表明长期低氧主要通过抑制GSK-3β的基因表达水平来保护器官免受低氧损伤和氧化应激。先前的研究报道，葛根素预处理可以通过抑制Akt信号通路来减轻心肌低氧损伤，而地塞米松部分通过激活Akt/GSK-3β通路为大鼠随后的低氧损伤提供强大的神经保护。本研究表明，与HH组相比，葛根素或地塞米松预处理在48小时增加了肝脏Akt和GSK-3β的mRNA水平，这表明葛根素或地塞米松对弹涂鱼肝脏和鳃低氧损伤的保护作用与Akt/GSK-3β信号通路有关。
Akt调节多个下游因子，包括转录因子、激酶和凋亡调节因子如p53。在本研究中，急性低氧胁迫可以在24和48小时上调肝脏p53和BNIP3的mRNA水平，这表明低氧可能通过p53/BNIP3信号通路诱导肝脏细胞凋亡。在鳃中，p53和BNIP3的mRNA水平显著增加，在48小时内增加了三倍以上，这可能是因为鳃是鱼类直接接触水环境的主要呼吸器官，因此鳃更容易受到低氧的影响。作为环境应激的通用传感器，p53过表达可能加剧氧化应激并促进暴露细胞的凋亡。本研究发现，预处理葛根素或地塞米松可以在24和48小时降低肝脏和鳃中p53和BNIP3的mRNA水平，这表明葛根素或地塞米松可能通过下调p53和BNIP3的基因表达水平来减轻低氧诱导的细胞凋亡，这一过程由Akt/GSK-3β通路介导。然而，在用葛根素和地塞米松预处理后，鳃中p53和BNIP3的基因表达水平在24和48小时仍高于HC组，这表明葛根素和地塞米松对低氧诱导的细胞凋亡效果有限。有趣的是，鳃Akt mRNA没有显著的时间效应和处理与时间交互作用，这表明鳃组织中Akt的转录调控不是对急性低氧的主要反应机制。这与鳃作为直接环境界面的作用一致，其中快速的生理调整（如血流和氧提取效率的变化）很可能是通过对现有蛋白质的翻译后修饰（例如磷酸化）来实现，而不是通过从头基因表达。相比之下，下游靶点如GSK-3β、HIF-1和VEGF的高度显著的交互作用表明该通路仍在功能上参与，但处于转录后水平。
HIF-1信号通路上调参与氧运输和利用的基因，如血管内皮生长因子(VEGF)，其为能量代谢提供氧输送支持。在不利条件下，升高的VEGF可以促进内皮增殖、血管生成和血管通透性，可能加剧低氧损伤。在我们的实验中，肝HIF-1α和VEGF mRNA水平在低氧后24和48小时显著上调，这可能促进了应对急性氧气短缺所需的血管适应。在鳃中，反应不同：VEGF mRNA仅在48小时增加，表明与肝脏相比，血管生成反应延迟。这可能是因为鳃已经高度血管化，赋予了更大的固有氧运输能力和低氧耐受性。在欧洲海鲈和斜带石斑鱼的低氧研究中也有类似HIF-1α和VEGF诱导的报道。葛根素和地塞米松预处理均能下调HIF-1α和VEGF的表达，这意味着它们可以使肝脏和鳃中低氧驱动的这些基因失调正常化，可能是通过Akt/GSK-3β信号通路。先前的研究证实，葛根素在应激下调节VEGF和HIF-1α的表达，而地塞米松在人类系统中有效抑制它们的诱导。作为与水生环境的主要界面，鳃预计会对低氧做出早期反应。确实，我们观察到在低氧后48小时，鳃组织中HIF-1α和VEGF mRNA显著上调，这与鳃在氧感应和血管适应中的作用一致。有趣的是，鳃中基因表达的时间模式与肝脏不同，肝脏显示出代谢基因（如LDH、PK）更早、更显著的变化，反映了其在全身能量代谢中的核心作用。这些组织特异性反应强调了低氧适应所需的复杂、多器官协调。总之，这些结果表明，葛根素和地塞米松可以部分通过调节HIF-1α/VEGF轴来改善低氧损伤。
本研究的一个局限性是缺乏血浆代谢参数，如葡萄糖、乳酸和皮质醇水平。这些指标为解释在肝脏和鳃中观察到的组织水平代谢酶和信号通路变化提供了有价值的系统背景。虽然我们以组织为重点的方法阐明了器官特异性的分子反应，但在未来的研究中整合血浆生化分析对于更全面地理解鱼类的系统低氧反应至关重要。
5. 结论
本研究得出以下结论：一方面，低氧应激通过p53/BNIP3通路触发细胞凋亡信号。另一方面，它同时通过Akt/GSK-3β通路介导上调HIF-1和VEGF表达，促进代偿性适应。此外，预处理葛根素或地塞米松被证明可以缓解低氧在弹涂鱼中诱导的不良生理效应。
