《mSystems》：Dysbiosis of fecal virome in pediatric Crohn’s disease and its dynamic changes during infliximab therapy
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本文研究了儿童克罗恩病（CD）患者肠道病毒组（virome）的变化及其在英夫利西单抗（IFX）治疗期间的动态演化。研究发现，与健康儿童相比，CD患儿的粪便病毒组物种丰富度降低，群落结构改变，功能从DNA修复向病毒复制组装偏移，且病毒-细菌跨界相关网络被破坏。该研究首次将病毒组与细菌组特征整合，构建了高准确度（AUC=89.3%）的CD诊断模型，并识别出与IFX治疗应答相关的特定病毒家族（如Microviridae, Siphoviridae），为儿童CD的诊断、预后预测及个体化治疗策略提供了潜在的生物标志物和新思路。
INTRODUCTION
克罗恩病（CD）是炎症性肠病（IBD）的一种主要亚型，其特征是胃肠道的慢性透壁性炎症、黏膜阿弗他溃疡和非干酪样肉芽肿。近几十年来，儿童期发病的IBD在全球范围内发病率不断上升。其确切的病因和发病机制尚不完全清楚，但越来越多的证据强调了肠道微生物群的关键作用。肠道微生物群失调可能破坏肠道免疫稳态，引发过度的免疫反应，最终导致慢性肠道炎症。近年来，肠道微生物群的另一个关键但研究不足的组成部分——肠道病毒组，正受到越来越多的关注。肠道病毒组主要由噬菌体和真核病毒组成，是肠道生态系统动态且不可或缺的一部分，新兴证据表明其在塑造宿主免疫和影响疾病结局方面具有潜在作用。目前，CD尚无根治方法，临床管理主要侧重于症状控制和长期维持。抗肿瘤坏死因子（TNF）单克隆抗体等生物制剂的问世开启了CD治疗的新时代，但仍有相当一部分患者无法获得充分的治疗反应。改善对生物制剂的临床反应仍是CD管理中的主要挑战。本研究旨在表征儿科CD患者的粪便病毒组组成，并探讨其与英夫利西单抗（IFX）治疗临床反应的关系。
MATERIALS AND METHODS
本研究经上海儿童医院区域伦理委员会批准。前瞻性招募了60名儿科CD患者和25名健康对照（HC）。在CD患者中，53人接受了至少三剂IFX治疗。纳入标准为新诊断的6至16岁CD儿童，排除极早发型IBD患者。CD的诊断依据波尔图标准，活动性疾病使用小儿克罗恩病活动指数（PCDAI）定义。IFX以5 mg/kg的剂量在0、2、6周静脉给药，随后每8周进行一次维持输注。根据对IFX治疗的临床反应对CD患者进行分类。缓解定义为治疗后PCDAI评分≤10，而PCDAI>10的患者被归类为未缓解。因此，患者被分为缓解组（IFX-R, n=41）和未缓解组（IFX-NR, n=12）。从所有参与者收集用于病毒组和细菌组分析的粪便样本。对粪便样本进行病毒样颗粒（VLP）富集，并通过宏基因组测序进行分析，同时通过16S rRNA基因测序评估细菌群落。使用R软件进行统计分析，包括Wilcoxon秩和检验、Spearman等级相关、线性判别分析效应大小（LEfSe）以及使用XGBoost构建分类模型。
RESULTS
临床特征与结局：共纳入60名儿科CD患者和25名性别、年龄匹配的HC受试者。CD患者的中位年龄为12.8岁，男性36名。与HC受试者相比，CD患者的体重指数（BMI）显著较低，大多数表现为回结肠受累（L3）。在CD队列中，53名患者接受了至少三剂IFX输注，其中41人获得临床缓解（IFX-R），12人未缓解（IFX-NR）。在基线时，缓解组和未缓解组之间的实验室和临床参数、PCDAI及粪便钙卫蛋白（FCP）无显著差异。在缓解组中，IFX治疗后观察到白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）、C反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）、血红蛋白（Hb）、PCDAI和FCP均有显著改善。相比之下，在非缓解组中，仅ESR在IFX治疗后显著下降。
儿科CD患者粪便病毒组的多样性和组成变化：从VLP宏基因组测序中，每个样本平均获得27,064,734条高质量读数。在纲和科水平上，粪便病毒组均表现出高度的个体间变异性，CD患者间的异质性尤为明显。与HC相比，除了Chao1指数外，病毒组群落的阿尔法多样性（alpha diversity）无显著差异。基于Bray-Curtis相异度的主坐标分析（PCoA）显示，两组间的病毒群落结构存在适度但统计学上显著的差异（R2=0.02, P=0.002）。LEfSe分析识别出与疾病状态相关的特定病毒特征。与HC相比，儿科CD患者的Caudoviricete和Anelloviridae的线性判别分析（LDA）评分显著更高。相反，HC中CrAss-like viruses、Microviridae和Inoviridae的LDA评分更高。科水平的组间比较显示，儿科CD患者的粪便样本中Anelloviridae、Genomoviridae、Myoviridae和Siphoviridae的相对丰度较高，而Inoviridae、Microviridae、Podoviridae和Virgaviridae的丰度低于HC。其中Anelloviridae、Microviridae和Virgaviridae的差异具有统计学显著性。此外，与HC相比，CD粪便病毒组中温和噬菌体比例更高，烈性噬菌体比例更低。
儿科CD患者粪便病毒组的功能变化：为研究粪便病毒组的功能变化，使用HUMAnN3和GO数据库对病毒序列进行注释，并通过LEfSe分析识别差异富集的功能。与HC相比，CD患者表现出显著的病毒功能谱偏移。在HC中，DNA解旋酶活性和DNA依赖性ATP酶活性等功能富集。相比之下，CD患者显示出与基因组复制（例如RNA解旋酶活性）、衣壳形成（T=1二十面体结构）和能量代谢（解偶联ATP酶活性）相关的病毒功能富集。
儿科CD患者粪便细菌组的多样性和组成变化：细菌16S rRNA基因测序显示，与HC相比，CD患者的细菌丰富度和多样性均显著降低。β多样性（beta diversity）分析显示，基于CD状态的样本呈现不同的聚类（R2=0.11, P=0.001）。在科水平上，与HC相比，儿科CD患者粪便样本中Acidaminococcaceae、Bacteroidaceae、Butyricicoccaceae、Christensenellaceae、Desulfovibrionaceae、Lachnospiraceae、Marinifilaceae、Monoglobaceae、Oscillospiraceae、Peptostreptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae和Tannerellaceae的相对丰度较低，而Aerococcaceae、Enterococcaceae和Morganellaceae的相对丰度较高。
CD中粪便病毒组与细菌组的跨界相关性：肠道病毒-细菌跨界相关性在健康和疾病中发挥着重要作用。我们进一步探讨了在CD和HC中差异显著的细菌和病毒物种之间的特定跨界关联。特别是，扭转环病毒13（Torque teno viruses 13）和大肠杆菌病毒phiV10（Escherichia virus phiV10）与几种有益细菌物种（如Blautia obeum和Romboutsia）呈显著负相关。
整合粪便病毒组和细菌组提高儿科CD的诊断准确性：为评估粪便病毒组的诊断潜力，我们开发了基于XGBoost的机器学习模型来区分儿科CD患者和HC。包含5个关键物种的病毒分类器实现了85.7%的曲线下面积（AUC）。同样，仅基于细菌特征的模型也实现了相当的性能（AUC=85.7%）。值得注意的是，结合病毒组和细菌组特征可改善诊断性能，集成模型的AUC达到89.3%，优于单独使用任一种数据类型的模型。
IFX改变了粪便病毒组：为研究IFX治疗期间肠道病毒组的动态变化，我们比较了治疗前（基线）和治疗后（IFX后）粪便样本中的病毒组群落。为减少个体间变异性的影响，仅纳入同时提供基线和治疗后样本的儿科CD患者（n=25）。除了Chao1指数外，CD患者IFX治疗前后的病毒组群落多样性未显示出显著变化。PCoA分析表明，基线和IFX后样本形成了不同的聚类，暗示微生物组成存在差异；然而，这种分离在统计学上不显著（R2=0.018, P=0.721）。LEfSe分析识别出造成观察到的差异的病毒类群：基线样本主要由Pbunavirus和假单胞菌病毒E215（Pseudomonas virus E215）组成，而IFX后样本则表现出不同的属和种范围。一些科的相对丰度在两组之间存在明显变化。箱线图显示了基线和IFX后各种病毒科的相对丰度，其中一些科在两组间的相对丰度存在明显差异（例如Anelloviridae和Microviridae）。
与IFX治疗结局相关的粪便病毒组变化：我们试图识别可作为IFX治疗反应指标的粪便病毒组特定特征。来自缓解期患者的粪便样本被归类为应答样本，而来自未缓解期患者的样本被归类为无应答样本。对IFX治疗前CD患者的分类谱比较分析显示，与缓解组（基线-R）相比，未缓解组（基线-NR）中包括Anelloviridae、Myoviridae和Podoviridae在内的几个病毒科相对丰度显著更高。相比之下，缓解组（基线-R）的Microviridae、Siphoviridae和Unclassified Caudovirales水平较高。IFX治疗后，缓解患者（IFX-R）的Anelloviridae、Genomoviridae、Microviridae、Podoviridae和Virgaviridae丰度增加，而非缓解患者（IFX-NR）则显示出更高的Myoviridae、Siphoviridae和unclassified Caudoviricetes丰度。
DISCUSSION
除了细菌和真菌，病毒也构成了人类肠道微生物群的很大一部分。人类肠道中的病毒包括感染原核细胞的噬菌体，以及感染真核细胞的DNA病毒和RNA病毒，其中噬菌体占主导地位。这些噬菌体大多属于Caudovirales目，以双链DNA基因组为特征，主要由Siphoviridae、Podoviridae、Myoviridae和CrAss样噬菌体科代表。尽管肠道细菌与CD之间的联系已很明确，但粪便病毒组的作用，尤其是在儿科CD患者中，仍然很大程度上尚未探索。我们的数据表明，与HC相比，儿科CD患者的粪便病毒物种丰富度显著降低，病毒组群落发生改变。儿科CD患者的Caudoviricete和Anelloviridae富集且LDA评分高。组间分类谱比较显示，CD儿童的Anelloviridae水平显著更高，而Microviridae和Virgaviridae水平显著更低。我们还观察到CD组中温和噬菌体比例更高，与先前的研究结果一致。温和噬菌体可以通过溶原性转换和水平基因转移调节细菌适应性，并有助于肠道微生物群的功能和分类多样性。在本研究中，儿科CD患者的病毒组功能也发生了改变，与基因组复制、衣壳形成和能量代谢相关的病毒功能富集，表明病毒活性和复制增加。肠道病毒和细菌之间的跨界相互作用对于维持肠道平衡和影响疾病进程至关重要。在CD患者中观察到病毒组-细菌组关联的显著改变，表明肠道微生物网络完整性被破坏。这些变化凸显了病毒组在维持微生物平衡和支持整体肠道健康方面的潜在作用。我们进一步开发了使用XGBoost的分类模型来区分CD患者和HC。结果表明，与单独基于任一数据集的模型相比，结合病毒和细菌特征进一步提高了分类准确性。这些发现凸显了单组学方法的局限性，并强调了整合多组学策略（特别是病毒组和细菌组数据的结合）对于增强儿科CD疾病预测的价值。
在本研究中，我们的结果表明IFX治疗影响了儿科CD患者的肠道病毒组，特别是在分类组成和某些多样性指标方面。我们的数据显示，基线组的特点是Anelloviridae和Microviridae丰度较高，而IFX后组中Genomoviridae、Myoviridae、Podoviridae、Siphoviridae和Virgaviridae更为丰富，这与先前关于IBD中病毒组紊乱的报告一致。CD儿童肠道病毒组的这些变化凸显了其在CD发生和发展中的重要作用。据我们所知，这项研究是第一个探索噬菌体谱与抗TNF治疗结局在儿科CD中关联的研究。我们的数据显示，最终获得缓解的CD儿童在开始IFX治疗前，其Microviridae、Siphoviridae和unclassified Caudoviricetes水平显著高于未缓解组，而未缓解组在治疗前则表现出Myoviridae和Podoviridae的过度表达。IFX治疗后，应答者比无应答者显示出更高的病毒多样性和更广泛的主要类群分布，表明在疾病缓解期间病毒组可能被重塑。
尽管本研究提供了新的见解，但我们的发现是初步的，需要在更大的队列中进行验证以确认观察到的趋势。首先，样本量小限制了统计功效和普遍性，特别是关于粪便病毒组与儿科CD中IFX治疗结局的关系。其次，病毒组和细菌组分析仅针对基线和治疗后一个时间点收集的粪便样本进行，这可能会稀释IFX输注的时间依赖性效应，并限制评估整个治疗过程中动态变化的能力。此外，我们的采样仅限于粪便材料，这可能无法完全代表更直接参与CD发病机制的黏膜病毒组群落。第三，未测量的混杂因素，如地理因素、饮食和环境暴露，可能影响了微生物组的组成。最后，本研究侧重于病毒组特征而非潜在机制。未来的研究应采用纵向、多中心设计，纳入黏膜组织分析，并使用无菌动物模型或体外系统来探索病毒在CD发病机制中的功能作用。
总之，本研究全面描绘了儿科CD中肠道病毒组的改变，突出了粪便病毒组在CD发病机制中的关键作用。此外，病毒组组成与IFX治疗后的结局密切相关，这强调了病毒组衍生生物标志物作为儿科CD患者疾病活动指标和IFX治疗反应预测因子的潜力。
