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为解决结核病（TB）早期诊断困难、传统方法耗时或需侵入性取样的问题，研究人员开展了一项概念验证研究。他们利用聚多巴胺（PDA）将具有不同脲酶活性的耻垢分枝杆菌（Mycolicibacterium smegmatis）菌株固定于丝网印刷电极（SPE）上，结合外源氧化还原介质（如蒽醌）进行电化学表征。结果显示，高脲酶活性菌株在蒽醌存在下产生更高的电流输出，表明电化学数据有望基于脲酶活性区分分枝杆菌菌株，为开发快速、非侵入性的致病性分枝杆菌筛查方法奠定了基础。
结核病（Tuberculosis, TB）至今仍是全球最主要的单一传染性病原体致死原因。尽管诊疗技术不断进步，但早期检测仍然是控制其传播的关键挑战。传统的、基于培养的“金标准”方法由于病原体倍增时间长达18-24小时而非常耗时，导致诊断和治疗延迟。而依赖痰液、支气管肺泡灌洗液等样本的传统诊断方法通常具有侵入性、难以获取（尤其对儿童和菌量少的病例），并且存在显著的生物安全风险。因此，开发快速、非侵入性的诊断方法，通过化学、电化学或光谱学手段检测或量化来自感染者或结核菌株的生物标志物，成为近年来的研究焦点。
在众多的潜在生物标志物中，脲酶（Urease）作为一种在致病菌中常见的毒力因子，能够催化尿素分解为CO2和NH3，使病原体能够碱化其周围环境，在酸性条件下生存。虽然研究仅提示脲酶在分枝杆菌毒力中发挥作用，但它在其他病原体（如幽门螺杆菌）中明确的致病作用使其成为一个有吸引力的检测靶点。基于电化学的脲酶检测技术以其高灵敏度、低成本、便携性等优势成为有吸引力的替代方案。
在此背景下，一项发表于《Bioelectrochemistry》的研究进行了一项概念验证，探索利用电化学技术直接基于脲酶活性筛查分枝杆菌菌株的可行性。该研究以非致病性的耻垢分枝杆菌（Mycolicibacterium smegmatis）为模型，旨在为未来开发针对致病性分枝杆菌（如结核分枝杆菌）的检测方法铺平道路。
研究者主要运用了以下关键技术方法：1) 菌株构建与培养：使用耻垢分枝杆菌野生型（WT）、其LCP蛋白家族基因敲除突变体（Δ0107，具有高脲酶活性）及回补菌株（c-0107）。2) 聚多巴胺（PDA）细胞固定化：将细菌细胞与多巴胺盐酸盐混合，通过有氧聚合形成PDA涂层，将细胞固定于丝网印刷电极（SPE）的工作电极表面，制备生物阳极。3) 场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）：用于观察PDA涂层中细菌细胞的形态和分布。4) 电化学表征：在含有外源氧化还原介质（铁氰化钾、蒽醌、核黄素）的电解液中，对制备的生物阳极进行循环伏安法（CV）和计时电流法（CA）测量，评估细菌的电活性及对不同浓度尿素的响应。5) 脲酶活性与尿素氮测定：使用商业试剂盒测定菌株的胞内和分泌型脲酶活性及尿素氮水平。
3.1. 场发射扫描电子显微镜
通过FE-SEM观察发现，PDA涂层中的耻垢分枝杆菌细胞保持了其形态，细胞壁结构完整性破坏最小，且在电极表面分布均匀。图像分析显示涂层厚度约为6.48 ± 0.34 nm。结果表明5 mM PDA稳定且对细菌细胞无毒，兼容性好，是一种理想的细胞固定化基质。
3.2. 氧化还原介质对生长的影响
评估了25和50 μM铁氰化钾、蒽醌和核黄素对耻垢分枝杆菌WT和Δ0107生长的潜在细胞毒性。在24小时培养期内，测试浓度下的氧化还原介质均未对细菌生长产生显著不利影响，表明在电化学测量所用浓度下，这些介质对耻垢分枝杆菌的毒性可忽略不计。
3.3. 氧化还原介质对耻垢分枝杆菌电活性的影响
在电解液中添加50 μM的氧化还原介质以增强电子转移。电化学分析表明，在测试的氧化还原介质中，只有蒽醌能显著增强耻垢分枝杆菌WT和Δ0107的电活性。来自CA的累积电荷输出也显示了相同趋势，蒽醌显著增强了两种菌株的电活性，而铁氰化钾和核黄素则没有。这可能是因为蒽醌的脂溶性有助于其穿透分枝杆菌厚而蜡质的细胞壁，且其氧化还原电位与分枝杆菌呼吸链成分（如甲萘醌）相匹配。
3.4. 基于脲酶活性的耻垢分枝杆菌电化学响应
为验证电化学信号能否基于脲酶活性区分菌株，研究人员在+0.4 V（vs. Ag伪参比电极）的施加电位下，在50 μM蒽醌存在时，表征了WT、Δ0107和c-0107生物阳极的电化学响应。在2000秒时，分步将尿素浓度从0.5 μM增加至2.5 μM。所有菌株均出现电流骤降后逐渐恢复的趋势，而细胞对照（无细胞）则显示瞬时尖峰和衰减。Δ0107（高脲酶活性）的稳态基线电流输出（~0.121 μA cm?2）高于WT（~0.087 μA cm?2），而回补菌株c-0107的信号与WT相似。结果表明，计时电流法信号可以为具有不同脲酶活性的菌株提供独特的电化学“指纹”。
3.5. 分泌型和胞内脲酶及尿素氮测定
生化测定阐明了菌株间电化学响应差异的原因。Δ0107突变体的胞内和分泌型脲酶活性均显著高于WT和c-0107。相应地，Δ0107的胞内和分泌型尿素氮水平也显著降低，表明其尿素水解增强。这可能是由于cpsA基因突变导致细胞包膜完整性改变，进而激活了应激响应通路，上调了脲酶活性作为生存机制。WT和c-0107的各项指标则无显著差异。
结论与讨论
本研究成功展示了一种新型的、基于聚多巴胺（PDA）导电涂层固定耻垢分枝杆菌细胞的生物电化学表征方法。该方法在非生长条件下能产生稳定且足够高的电流输出。关键的发现是，LCP蛋白敲除突变体（Δ0107）表现出比野生型（WT）及其回补菌株（c-0107）更高的胞内和分泌型脲酶活性及尿素氮利用能力。在测试的多种氧化还原介质中，仅有50 μM的蒽醌能显著增强所有菌株的电化学信号，这表明蒽醌与分枝杆菌的呼吸链具有独特的兼容性。最重要的是，具有不同脲酶活性水平的菌株产生了独特的电化学信号，这为基于脲酶活性快速筛查致病性分枝杆菌菌株提供了一种潜在的分析方法原理验证。
这项研究的意义在于，它首次将电化学脲酶检测方法应用于直接筛查分枝杆菌细胞，为开发快速、低成本、可能实现非侵入性取样（例如尿液）的结核病即时检测（Point-of-Care, POC）工具奠定了重要的技术基础。由于使用了非致病性的耻垢分枝杆菌作为结核分枝杆菌的安全模型，该平台还可用于安全地研究特定突变体对抗菌剂或材料的代谢反应。当然，该概念验证研究也存在一些局限，例如未在临床相关基质中测试、机制尚未完全明确、需进一步在包含不同脲酶活性临床分离株的更大样本中验证等。未来的工作可以整合概率机器学习框架来分析电化学数据集，以提高检测的定量化和临床决策支持能力。总体而言，这项研究为将生物标志物发现转化为经济高效、用户友好的结核病诊断方法迈出了有希望的一步。
