单细胞分析和RNA测序技术揭示了vedolizumab治疗溃疡性结肠炎时患者无应答的机制及疗效生物标志物

《Chinese Medical Journal》：Single-cell and RNA sequencing identify mechanisms of primary non-response and efficacy biomarkers for vedolizumab-treated ulcerative colitis

溃疡性结肠炎患者对 vedolizumab 治疗的原发无应答机制及预测生物标志物研究。采用单细胞转录组测序和 bulk RNA-seq 分析发现 β2 整合素/ICAM1 介导的免疫细胞异常迁移与持续炎症相关，并鉴定出 9 个预测 VDZ 响应的生物标志物。

　　

致编辑：溃疡性结肠炎（UC）的全球发病率和患病率正在稳步上升。^[1]尽管生物制剂和小分子药物带来了显著的治疗进展，但原发性无反应和继发性反应丧失等挑战仍然普遍存在。

维多珠单抗（VDZ）是目前唯一获批用于治疗中度至重度UC的肠道选择性生物制剂，显示出良好的疗效和安全性。然而，大约20-40%的患者在治疗的第14周会出现原发性无反应（PNR）。^[2]先前的研究表明，仅凭药代动力学、血清药物浓度和免疫原性等因素不足以解释PNR的机制。^[3,4]本研究旨在利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术探讨VDZ在UC中的PNR细胞机制，并识别能够预测治疗效果的生物标志物。

本研究已获得昆明医科大学第一附属医院伦理委员会的批准（批准编号2023L168），并遵循《赫尔辛基宣言》进行。所有参与者在入组前均签署了书面知情同意书。研究设计的示意图见补充图1，https://links.lww.com/CM9/C777。我们回顾性分析了2020年6月至2023年10月期间接受VDZ治疗的59名UC患者的疗效，患者基线特征见补充表1，https://links.lww.com/CM9/C778。其中，18名患者通过乙状结肠组织样本进行了scRNA-seq分析，包括5名健康对照组（HC，定义为未患系统性疾病且结肠镜检查正常的个体）、5名仅接受美沙拉嗪治疗的轻度UC患者（NP，Mayo内镜评分[MES] = 2）、4名VDZ治疗14周后出现原发性无反应的患者（PNR，MES = 3），以及4名实现早期黏膜愈合的患者（EMH，MES = 0）。纳入患者的详细临床特征见补充表2，https://links.lww.com/CM9/C779。RNA测序（RNA-seq）是在VDZ治疗前采集的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肠道组织上进行的，包括所有用于scRNA-seq分析的PNR和EMH患者的样本。通过整合scRNA-seq和RNA-seq数据，我们试图识别VDZ在UC中的预测性生物标志物。这些候选标志物随后使用外部公开数据集（GSE73661）进行了验证。实验程序、材料和统计分析的详细描述见补充材料https://links.lww.com/CM9/C777和补充表3–5https://links.lww.com/CM9/C778。

VDZ疗效分析显示，到第14周时，68%（40/59）的患者达到了临床反应，46%（27/59）的患者达到了临床缓解，37%（22/59）的患者达到了无类固醇的临床缓解。在所有患者中，30名患者完成了52周的VDZ治疗，其中60%（18/30）达到了临床缓解和无类固醇缓解[补充图2A，https://links.lww.com/CM9/C777https://links.lww.com/CM9/C777https://links.lww.com/CM9/C777https://links.lww.com/CM9/C777]。此外，与之前接受过生物制剂治疗的UC患者相比，未经生物制剂治疗的UC患者在第14周和第52周的临床反应率和缓解率显著更高[补充图2E, F，https://links.lww.com/CM9/C777https://links.lww.com/CM9/C777], 并且低蛋白血症和贫血得到了纠正[补充图2K, L，https://links.lww.com/CM9/C777]。最后，多变量逻辑回归分析表明，既往的免疫抑制治疗是独立的保护因素，而VDZ治疗期间同时使用糖皮质激素是第14周临床反应的独立风险因素[补充表6，https://links.lww.com/CM9/C778。

为了探究UC患者对VDZ原发性无反应的潜在机制，我们对18名个体的肠道组织进行了10倍基因组scRNA-seq分析，包括HC、NP、PNR和EMH，从而构建了不同疾病状态下肠道微环境的全面单细胞图谱。经过严格的质量控制程序后，共获得了108,641个高质量细胞用于后续分析。基于典型标记基因表达的注释识别出8种主要细胞类型[补充图3A–C，https://links.lww.com/CM9/C777]。比例分析显示，UC患者的上皮细胞显著减少，而活动性疾病患者中B细胞和浆细胞的浸润占主导[补充图3D，https://links.lww.com/CM9/C777。

排除神经元后，对7种主要细胞类型进行亚群分析，识别出49种注释的细胞亚型[补充图4A, B，https://links.lww.com/CM9/C777]。对VDZ的主要靶细胞T淋巴细胞亚群的比例分析显示，UC患者中的T细胞组成发生了显著变化。值得注意的是，达到EMH的患者的CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞亚群的比例与HC患者有显著差异[补充图4C，https://links.lww.com/CM9/C777]。差异基因表达分析进一步表明，CD4_ITGAE_Trm、CD8_IFNG_Cytotoxic和CD8_KLRB1_MAIT细胞亚群在EMH组中富集，并表现出高水平的细胞毒性效应基因表达，包括IFNG、NFKBIZ、GZMA、GZMB和GZMK [补充图4D, E，https://links.lww.com/CM9/C777。

鉴于VDZ通过选择性靶向整合素α4β7发挥治疗作用，我们评估了不同疾病状态下HC和UC患者肠道黏膜中的α4β7⁺细胞数量。有趣的是，PNR组中的α4β7⁺ CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞和浆细胞数量显著减少，而NP、EMH和HC组中的这些细胞数量则没有显著差异[补充图5A，https://links.lww.com/CM9/C777]。然而，另一组使用免疫荧光（IF）、Western blotting和定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）的结果显示，NP和PNR组肠道黏膜中的α4β7阳性细胞数量以及α4β7蛋白和mRNA表达水平显著升高[补充图5B–F，https://links.lww.com/CM9/C777。

先前的研究以及我们的单细胞转录组数据表明，目前的VDZ治疗剂量几乎完全阻断了整合素α4β7，有效抑制了负责免疫细胞向肠道迁移的α4β7/Madcam-1通路。然而，尽管如此，肠道炎症仍然持续存在，这表明存在其他迁移途径。为此，我们进行了CellChat分析，以绘制T淋巴细胞和内皮细胞之间的受体-配体相互作用，发现细胞间粘附分子（ICAM）和整合素亚单位β2（ITGB2）信号通路显著富集[图1A, B。与EMH组相比，PNR组通过ICAM1-ITGAL_ITGB2、ICAM1-ITGAL和ITGB2-ICAM1通路的相互作用显著增强，促进了内皮细胞与CD4_GZMA_Effector T细胞和CD8_TNFRSF9_Cytotoxic T细胞之间的强烈相互作用[补充图6A, B，https://links.lww.com/CM9/C777]。独立队列的IF、Western blotting和RT-qPCR分析进一步证实，PNR组肠道黏膜中的αLβ2和αMβ2阳性细胞数量显著增加，ITGAL、ITCAM、ITGB2和ICAM1的蛋白和mRNA表达水平也升高[补充图6C–G，https://links.lww.com/CM9/C777]。进一步的亚群分析确认，PNR组中的CD4_GZMA_Effector T细胞和CD8_TNFRSF9_Cytotoxic T细胞中αLβ2和αMβ2的表达上调[补充图6H，https://links.lww.com/CM9/C777], 这表明β2整合素/ICAM1介导的免疫细胞迁移可能是PNR患者肠道炎症持续存在的关键机制。

图1：

研究UC患者对VDZ原发性无反应的机制及预测性生物标志物。(A) 串联图展示了HC、NP、PNR和EMH组肠道黏膜组织中细胞类型之间的ITGB2相关信号网络相互作用。线条的粗细代表细胞相互作用的强度。(B) 同四组中细胞类型之间的ICAM相关信号网络串联图，线条粗细表示相互作用强度。(C) 本研究中RNA-seq数据中Vein_iii内皮细胞的前15个标记基因的表达评分。(D) 评估当前研究数据集中Vein_iii内皮细胞预测价值的ROC曲线分析。(E) 当前RNA-seq数据集中Pre_PNR组和Pre_EMH组之间差异表达基因（DEGs）的ssGSEA表达评分。(F) 当前RNA-seq数据集中所有9个基因的ROC曲线。AUC：曲线下面积；ROC：接收者操作特征；VDZ：维多珠单抗；UC：溃疡性结肠炎；ITGB2：整合素亚单位β2；PNR：原发性无反应；EMH：早期黏膜愈合；ICAM：细胞间粘附分子；DEG：差异表达基因。

为了识别VDZ疗效的预测性生物标志物，在VDZ治疗前收集了被分类为PNR和EMH的UC患者的FFPE肠道黏膜组织，并进行了批量RNA-seq和多重免疫组化（mIHC）分析。利用49个注释细胞亚群中的前15个标记基因，单样本基因集富集分析（ssGSEA）显示，Pre_PNR组中的Vein_iii内皮细胞簇评分——指示细胞丰度——显著高于Pre_EMH组[图1C，和补充图7A，https://links.lww.com/CM9/C777。接收者操作特征（ROC）分析进一步证明了Vein_iii内皮细胞对VDZ治疗反应的预测价值，内部转录组数据集的AUC值为0.80，外部公共数据集的AUC值为0.65[图1D，和补充图7B，https://links.lww.com/CM9/C777。在独立队列中的mIHC验证确认，Pre_PNR组的Vein_iii细胞总数和ICAM1+ Vein_iii细胞数量均高于Pre_EMH组[补充图7C, D，https://links.lww.com/CM9/C777]。比较Pre_PNR组和Pre_EMH组之间的差异表达基因（DEGs）发现了9个在Pre_PNR组中上调的共有基因[补充图7E–G，https://links.lww.com/CM9/C777]。ssGSEA和ROC分析显示，这9个基因的签名具有预测VDZ反应性的潜力，内部数据集的AUC为0.99，外部数据集的AUC为0.67[图1E, F，和补充图7H, I，https://links.lww.com/CM9/C777]。值得注意的是，所有9个单独基因的AUC均超过0.7[补充图7J，https://links.lww.com/CM9/C777]。IF进一步验证，在Pre_PNR患者的肠道黏膜中，这9个基因的表达显著升高[补充图7K，https://links.lww.com/CM9/C777]，这共同支持它们作为VDZ治疗结果预测性生物标志物的潜力。

我们的发现强调了β2整合素/ICAM1相互作用介导的免疫细胞肠道迁移在VDZ治疗UC患者中的显著个体间差异，这可能是PNR的潜在驱动因素。

本研究初步评估了PNR患者肠道黏膜中ICAM1⁺ Vein-iii内皮细胞和9个上调基因——CCDC3、CD93、CDH6、EBF1、G0S2、MMRN1、SNX10和TLR2的表达，表明它们作为预测PNR和EMH的生物标志物的潜力。它们的临床实用性需要在大规模前瞻性队列中进一步验证。

本研究的局限性主要源于样本量较小，导致AUC值波动较大。将进行中心间验证，以评估所提出的生物标志物的预测能力和普遍性，从而推动UC精准医学的发展。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号82170550、82160107、82260108和82360107）、云南省应用基础研究基金（编号202301AT070131、202201AY070001-048和202301AT070091、202301AS070027）、云南省青年人才计划（编号RLQB20220004）、昆明医科大学第一附属医院535人才项目（编号2023535D06和2023533Q03）、炎症性肠病单细胞测序应用专项基金（编号7012204）以及昆明医科大学皮肤与黏膜再生医学一流学科团队（编号2024XKTDTS10）的支持。

利益冲突

无。