下丘脑视交叉上核内从AVP神经元到VIP神经元的GABA能网络精确设定昼夜行为节律的时序

《PLOS Biology》：A GABAergic network from AVP- to VIP-neurons in the suprachiasmatic nucleus sets the timing of circadian behavior rhythms

本文揭示了下丘脑视交叉上核(SCN)作为哺乳动物中枢生物钟，其内部由血管升压素(AVP)神经元向血管活性肠肽(VIP)神经元释放的γ-氨基丁酸(GABA)构成了一个关键的神经调控网络。研究通过特异性基因敲除、在体钙成像和光遗传学等技术，首次阐明该GABA能网络通过抑制中间神经元，间接去抑制（即激活）VIP神经元，从而精确调控行为活动/休息的起止时间。这一发现不仅深化了对昼夜节律中枢时钟运作机制的理解，也为相关节律紊乱疾病的干预提供了新靶点。

　　

昼夜节律中枢的神经化学异质性网络

下丘脑视交叉上核(SCN)是哺乳动物的中枢生物钟，协调着体内的多种昼夜节律。SCN由大约20,000个细胞组成，其细胞能够通过以Bmal1、Clock、Per1/2/3、Cry1/2等时钟基因构成的自调节转录翻译反馈环(TTFL)产生细胞自主的昼夜振荡。然而，SCN内部细胞间的通讯对于产生稳健、一致的节律至关重要。SCN本质上是一个神经化学异质性的γ-氨基丁酸(GABA)能神经元网络，其中位于SCN背内侧区（壳区）的产生血管升压素(AVP)的GABA能神经元和位于腹外侧区（核区）的产生血管活性肠肽(VIP)的GABA能神经元是两种主要的神经元类型。VIP被认为是维持和同步SCN神经元活动的关键因子，而AVP神经元则被认为是决定SCN网络产生的节律周期长度的主要起搏细胞。尽管如此，GABA介导的信号在SCN网络中的功能作用仍然存在争议。

AVP神经元特异性缺失VGAT延长活动时间并压缩VIP神经元的高钙活动期

为了探究SCN中AVP神经元释放的GABA如何调控VIP神经元，研究首先在AVP神经元特异性囊泡GABA转运体(VGAT)基因敲除(简称Avp-Vgat^-/-)的小鼠中，通过光纤光度法在体记录了SCN VIP神经元的细胞内钙离子(Ca²⁺)信号（VIP-Ca²⁺）节律。VGAT负责将GABA装载入突触小泡，其缺失会阻断GABA的突触释放。

在对照小鼠中，VIP-Ca²⁺节律与自主活动节律反相同步，高Ca²⁺水平贯穿整个行为休息期。而在Avp-Vgat^-/-小鼠中，行为活动时间（活动开始到结束的间隔）显著延长，同时VIP-Ca²⁺节律的形态发生改变。具体表现为，在恒定黑暗(DD)条件下，VIP-Ca²⁺上升到峰值所需时间更长，导致高VIP-Ca²⁺的持续时间（以峰值至谷值振幅的50%或80%为阈值计算）显著缩短。这种高VIP-Ca²⁺持续时间的压缩，恰好与行为活动时间的延长互补。有趣的是，尽管持续时间改变，但VIP-Ca²⁺节律与自主活动之间的相位关系在敲除鼠中基本得以维持。这些结果提示，来自AVP神经元的GABA调控着VIP神经元高Ca²⁺活动的时序，其缺失可能导致早晨自主活动结束的延迟。

VIP神经元特异性敲除GABA_A受体缩短活动时间并延长高钙活动期

如果AVP神经元通过GABA能信号调控VIP神经元，那么VIP神经元上的GABA_A受体(GABA_AR)应该在此过程中扮演关键角色。为了验证这一点，研究采用了一种创新的在体基因组编辑方法。他们构建了VIP神经元特异性表达Cre重组酶的小鼠，并将其与Cre依赖的SpCas9表达小鼠杂交。然后，向这些小鼠的SCN注射混合的腺相关病毒(AAV)，这些病毒同时表达靶向GABA_AR所有三个β亚基基因(Gabrb1, Gabrb2, Gabrb3)的向导RNA(gRNA)，从而在VIP神经元中同时破坏这三个基因的功能，产生了VIP神经元特异性GABA_AR敲除(简称Vip-GABA_AR^-/-)小鼠。电生理记录证实，这些VIP神经元中几乎完全消失了GABA_AR介导的突触后电流。

行为学分析发现，在DD条件下，Vip-GABA_AR^-/-小鼠的早晨自主活动水平显著降低，且活动结束得更早、更不明显，导致整体的行为活动时间缩短。然而，其自由运行周期并未发生显著改变。这表明，由于缺乏GABA_AR，VIP神经元可能无法被抑制，从而反而抑制了早晨的自主活动。

接下来，研究在体记录了这些小鼠的VIP-Ca²⁺节律。结果显示，Vip-GABA_AR^-/-小鼠的VIP-Ca²⁺水平在早晨开始上升的时间更早，且上升到平台期所需时间更长，傍晚下降的速度也更慢。因此，在DD条件下，高VIP-Ca²⁺的持续时间（以20%或50%峰值为阈值）显著延长，这与行为活动时间的缩短相一致。此外，敲除鼠VIP-Ca²⁺在平台期的波动性增大。这些发现进一步证实了GABA能输入在调控VIP-Ca²⁺和行为节律中的关键作用。

光遗传学激活AVP神经元以时间和GABA依赖的方式增加VIP神经元钙活动

为了直接探究AVP神经元与VIP神经元之间的功能连接，研究采用了光遗传学结合在体钙成像的技术。在对照小鼠的AVP神经元中特异性表达光敏感通道ChrimsonR，同时在VIP神经元中表达钙指示剂jGCaMP7s。结果显示，在夜间（当VIP神经元基础Ca²⁺水平较低时），光遗传学激活AVP神经元能够增加VIP-Ca²⁺水平；而在白天（当VIP神经元基础Ca²⁺水平已较高时），则没有此效应。这种VIP-Ca²⁺的升高是ChrimsonR特异性的，因为表达对照荧光蛋白mCherry时未观察到响应。

更重要的是，当在Avp-Vgat^-/-小鼠中进行同样的实验时，由ChrimsonR刺激诱发的夜间VIP-Ca²⁺增加被显著减弱。这强有力地表明，AVP神经元释放的GABA是驱动VIP神经元激活的主要介质。

GABA_A受体拮抗剂升高VIP神经元基础钙并抑制其对AVP神经元激活的反应

为了在更受控的条件下解析AVP神经元调控VIP神经元的环路机制，研究在SCN脑片水平进行了实验。同样在AVP神经元表达ChrimsonR，在VIP神经元表达jGCaMP7s。在脑片环境中，光遗传激活AVP神经元同样能增加VIP-Ca²⁺。

一个关键的发现是，单独应用GABA_AR拮抗剂加巴嗪(gabazine)就能升高VIP神经元的基础Ca²⁺水平。这提示，在夜间，VIP神经元作为一个群体，正受到GABA的抑制性调控。更有甚者，在加入加巴嗪后，由AVP神经元光激活所诱发的VIP-Ca²⁺增加被大幅抑制。这些看似矛盾的数据——即阻断GABA信号本身能激活VIP神经元，而AVP神经元释放GABA也能激活VIP神经元——可以通过一个“去抑制”环路模型得到完美解释：AVP神经元释放的GABA，首先抑制了另一群“中间”的GABA能神经元，而这群中间神经元原本是持续抑制VIP神经元的。因此，AVP神经元的激活，通过抑制“抑制者”，间接地“去抑制”或激活了VIP神经元。

光遗传学激活SCN AVP神经元降低相邻非AVP细胞的钙活动

如果上述“去抑制”模型成立，那么应该存在一群能被AVP神经元抑制的中间神经元。为了验证这一点，研究绘制了SCN脑片中非AVP细胞对AVP神经元光激活的Ca²⁺响应空间图谱。通过在AVP神经元表达ChrimsonR，同时在非AVP细胞表达jGCaMP7s，他们观察到，在AVP神经元激活后不久，SCN大部分区域（尤其是位于AVP富集区与VIP富集区之间的中间区域）的非AVP细胞Ca²⁺信号开始下降。随着刺激持续，一些区域（如腹侧区）的信号逐渐恢复并转为兴奋，而中间区域的细胞则倾向于表现出更强的抑制性反应，兴奋不明显。单独应用加巴嗪同样能升高这些非AVP细胞的基础Ca²⁺水平，且由AVP神经元激活诱导的Ca²⁺反应在加巴嗪存在时被基本消除。这些结果直接证实了存在能被AVP神经元通过GABA_AR抑制的细胞群体，为“去抑制”环路提供了证据。

讨论与模型：一个精细调谐活动/休息时序的GABA能网络

综合上述发现，本研究提出了一个关于SCN内AVP神经元到VIP神经元的GABA能网络如何设定昼夜行为时序的工作模型。在正常小鼠中，AVP神经元释放的GABA，尤其是在早晨（也在一定程度上在傍晚），抑制了位于SCN中间区域的GABA能中间神经元。这群中间神经元原本对VIP神经元施加着持续的抑制性张力。因此，AVP神经元的激活，通过解除中间神经元对VIP神经元的抑制（即“去抑制”），从而激活了VIP神经元。被激活的VIP神经元进而通过下游通路抑制自主活动，主要塑造了早晨的自主活动及随后的休息开始时间。

在Avp-Vgat^-/-小鼠中，AVP神经元无法释放GABA，导致在早晨无法有效去抑制VIP神经元。其结果是VIP神经元的高Ca²⁺期延迟，早晨自主活动的结束时间相应推迟，行为活动时间延长。相反，在Vip-GABA_AR^-/-小鼠中，VIP神经元对中间神经元释放的GABA不敏感，等同于丧失了抑制性输入。这导致VIP神经元在早晨更早被激活（高Ca²⁺期提前并延长），从而更早地抑制了早晨的自主活动，使行为活动时间缩短。

值得注意的是，AVP神经元和VIP神经元的节律（包括TTFL振荡）在这些基因工程小鼠中基本保持正常，自由运行周期也未改变。这表明，AVP神经元来源的GABA主要是在不改变核心生物钟“计时”功能的前提下，精细地“调校”了VIP神经元的活性输出时间窗口，从而决定了行为活动相的起止“闹钟”。这个GABA能网络是方向性的、非对称的，强调了在探究SCN功能时区分GABA能信号传递方向的重要性。

本研究的发现深化了我们对中枢生物钟内部环路机制的理解，揭示了特定的神经调质网络如何将内在的分子钟时间信息转化为精确的行为输出。这不仅具有重要的基础理论价值，也为治疗因生物钟失调导致的睡眠障碍、轮班工作不适应等疾病提供了新的潜在干预靶点和思路。