《Current Opinion in Biotechnology》：Non-model microbes and microbial communities: opportunities for biotechnology
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本综述系统阐述了从传统模型微生物单菌研究向非模型微生物及合成微生物群落（SynComs）研究的范式转变。文章指出，组学技术和自动化手段极大地扩展了可用于生物技术的非模型微生物资源库，使其既能作为独立底盘，也能作为模块用于构建具有新兴功能（emergent functions）的合成群落。与单一培养相比，设计良好的微生物群落具有更高的鲁棒性、可处理复杂底物并适用于开放环境应用。文章还回顾了包括定向基因组编辑、适应性实验室进化（ALE）和生态工程在内的多种工程化工具。未来，加强对非模型微生物的研究和合成群落设计方法的开发，是解锁其丰富功能潜力的关键。
引言
长期以来，微生物学和工业生物技术的研究焦点都集中在单一菌株的分离和培养上。这种单一培养方法实现了研究的可重复性，并成功用于药物、食品化合物和生物燃料等产品的生物生产。然而，大多数这类生物技术仅局限于少数几种得到充分研究的模式生物，如大肠杆菌Escherichia coli和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。这种对少数微生物的依赖限制了可利用的底物和产物范围，增加了污染风险，并对规模化生产提出了挑战。相比之下，依赖微生物群落（包括含有工程化模式生物的群落）的过程，因其多物种组装的固有鲁棒性，可能缓解这些限制。
随着宏基因组学等组学技术的发展，微生物学家得以在微生物群落层面解读生物功能。越来越多的研究表明，复杂的生物功能往往源自群落中非模型微生物之间的相互作用所涌现的新兴功能，而非单个菌株的功能。例如，利用牛奶作为底物是开菲尔（kefir）微生物群落的一种涌现特性，其中不同菌株执行互补的代谢过程。因此，要充分探索微生物群落的涌现特性，需要在群落背景下对模式和非模式生物进行研究。
微生物群落工程为通过组合具有互补能力的天然或工程化生物来创造新兴功能特性提供了机遇。这引入了生物技术领域的一个范式转变：将合成生态学作为功能工程的框架。合成群落，有时称为SynComs，是经过有意设计的、由两个或更多微生物菌株或物种组成的、能够稳定共存的组装体。这些群落通常被构建用于实现特定的功能目标，如代谢物生产、环境修复或生态系统模拟。
将非模型微生物发展为功能性合成群落的组成部分
在生物技术中常用的模式微生物生产底盘，其特征是可重复的培养条件、明确的生理学特性以及可用的遗传工具。最近，模式生物的概念已扩展至包含一系列具有不同表征水平的物种。与传统的模式微生物（如E. coli和S. cerevisiae）不同，这些新兴模式通常研究得不够全面。在生物技术中，利用促进特定应用的天然菌株特性，推动了多样化生物的采用。例如，恶臭假单胞菌Pseudomonas putida表现出对化学胁迫的高耐受性，使其非常适合生物修复；而盐单胞菌属Halomonas sp.具有高耐盐性，使得在海洋或高盐度环境中的生物过程成为可能。
重要的是，非模型微生物的潜力不仅限于其在单一培养中的应用。这些生物也可以作为合成微生物群落内的模块化组件，贡献独特的能力，从而产生与生物技术应用相关的涌现的群落水平性状。工程化微生物群落代表了从单菌株优化到群落水平功能网络设计的概念转变。虽然这一转变带来了额外的挑战，但也创造了新的机遇。在某些情况下，难以用单一培养方法解决的复杂问题，可能通过微生物相互作用产生的涌现功能变得更容易处理。例如，虽然在不需有机生长因子的模式生物E. coli中工程化CO2固定被证明是费力的，但通过将E. coli与自养蓝细菌聚球藻Synechococcus elongatum共培养可以实现负碳生物合成，后者充当了CO2封存模块。这种模块化设计策略具有高度通用性，因为S. elongatum已成功与多种生产底盘（包括细菌、酵母和丝状真菌）共培养，实现了高达每公斤产品440公斤CO2的负碳足迹。
天然微生物组代表了具有群落适应性性状的生物的储存库，使其成为构建合成群落的有价值的功能模块。然而，它们的有效利用通常取决于遗传工具和功能基因组学信息的可用性。为了优先考虑遗传上易操作的菌株，环境转化测序（ET-Seq）能够识别天然微生物组中适合遗传转化的生物。为了加速兼容遗传元件的筛选，POSSUM工具包包含了22个广宿主范围质粒复制起点（ORIs）。通过将混合质粒文库转化到非模型微生物中，可以通过测序并行识别兼容的遗传元件，从而为12种被测细菌中的7种鉴定出ORI。
或者，非模型生物可以通过适应性实验室进化（ALE）进行工程化，该技术利用自然选择来富集赋予适应性优势的突变。虽然ALE传统上用于选择改善的生长，但最近的进展已将其应用扩展到其他性状。例如，已使用ALE在计算设计的、将细胞适应性增强与代谢物分泌耦合的选择性环境中优化了目标代谢物的生产。
对于合成生态学中的生物，关键关注的性状包括代谢依赖性和分泌能力，如维生素或氨基酸营养缺陷型。虽然代谢建模可用于预测这些性状，但其准确性通常受到非模型微生物中功能注释不完整的限制。高通量功能基因组学方法可以帮助弥补这一注释缺口。例如，Coaux-Seq已被用于筛选来自不同细菌的基因组文库，以评估其互补营养缺陷型E. coli宿主的能力，为51种蛋白质（包括几种与先前表征的营养缺陷型相关基因高度不同的蛋白质）提供了初步功能注释。此外，已使用混合和阵列化的全基因组突变体文库来系统性地识别营养缺陷型基因敲除，这些敲除受益于废培养基或共培养期间存在的分泌代谢物。
最后，自动化和高通量培养组学正在扩展可作为合成群落功能模块的微生物目录。主要的培养物保藏中心，如美国模式培养物集存库（ATCC）和德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ），增加了对微生物菌株的获取，从而加速了低温保存优化、表型表征和基因组测序工作。例如，DSMZ的BacDive数据库包含近100,000种微生物菌株的表型信息。该资源可以与基因组数据和机器学习方法相结合，以预测先前未表征生物中的生理性状和生长需求。
用于研究和生物技术应用的微生物群落的表征与功能监测
微生物群落通过超越单个菌株功能的新兴代谢功能提供了生物技术潜力。理解它们的组装动态对于确保合成和天然群落的生态稳定性与功能鲁棒性至关重要。群落稳定性可以从功能和生态两个角度来看。功能稳定性指的是在不同条件和时间内维持群落涌现功能，而生态稳定性指的是群落组成的持久性，允许数量波动但排除持续的物种更替。这些定义不是绝对的，有限的物种交换可能仍与相对稳定性一致，特别是在非常大的群落中。
合成微生物群落的有效设计需要仔细考虑物种兼容性和生态相互作用。诸如竞争排斥和代谢不相容性等限制需要战略性的物种选择。这可能包括选择共存于同一栖息地的菌株（例如，共分离的菌株），确保代谢互补性，并通过扩增子测序验证可区分性。生长条件可用性等实际限制进一步影响群落设计。系统组装策略和工具（如AutoCD）支持理性设计和预测稳定性建模。
群落功能与组成密切相关，因此精确监测至关重要。已开发了各种组学工具来追踪微生物动态，包括结合宏基因组学的扩增子测序（16S rDNA或ITS）、单独的宏基因组学、基于13C的蛋白质组学和宏蛋白质组学。在16S rDNA缺乏菌株水平分辨率的情况下（例如，对于近同基因多菌株组装），合成基因组条形码提供了一种强大的解决方案：用MoBacTags标记的菌株能够与16S引物共同扩增，以同时进行分类学和功能追踪。当需要时，绝对（而非相对）定量可以通过添加内标来实现，内标可以是分类学上不同的物种或其他内标标准品，例如合成DNA。功能稳定性可以使用荧光标记的底物来追踪化合物的降解，从而进行监测。环境因素，如营养缺陷型补充、初始接种比例和总微生物负荷，会关键性地塑造群落结构。此外，初始条件可能导致替代的稳定状态，这突显了精心实验设计的重要性。
微生物群落已被开发用于一系列研究和工业目的。著名的合成群落模型包括用于生态学研究的33菌株群落、研究抗生素驱动组成变化的62菌株群落，以及评估物种特异性抗生素预暴露效应的23菌株系统。这些组装体涵盖了人类、动物和环境来源。一些群落复制了自然生态系统，如Cheng等人的119种肠道群落，该群落定植于小鼠并反映了人类微生物群相关的表型。同样，Garcia-Santamarina等人和Wuyts等人利用32种肠道群落，通过多组学分析研究了群落水平现象，如药物扰动、交叉保护和交叉致敏。
尽管完全合成的系统具有吸引力，但由于其共同进化的相互作用，天然或半天然微生物群落通常提供更优的稳定性和功能性。例如，发酵食品群落（如康普茶和牛奶开菲尔）表现出高生产力和动态稳定性。生物工程师越来越多地通过体外进化、选择性富集以及靶向物种去除或添加来操纵这些群落，以利用这些性状。Ruan等人例证了这种方法，他们使用整合自上而下和自下而上策略的代谢建模流程来工程化用于生物修复的微生物组——在保持生态功能的同时优化性能。自上而下策略允许从复杂群落中富集所需功能，例如，在选择性压力下培养来自除草剂污染环境的土壤微生物组，以识别和保留关键的降解菌。虽然这种方法可以接触到难以培养的微生物并保留复杂的性状，但在实验室条件下，它常常受到稳定性和可扩展性降低的困扰。在培养过程中，组成漂移通常会导致具有改变功能的半天然组装体。
自下而上的方法，即从单菌株分离物构建群落，提供了对物种组成和代谢途径的精确控制，使其在生物生产中特别有效。例如，工程化枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis与谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的共培养将芬芥素（fengycin）产量从约600毫克/升提高到1220毫克/升，在优化条件下达到3290毫克/升。功能群落已被设计用于多种应用，包括风味调节、增强的氧耐受性、高密度生长、化学交叉保护和可持续生产。一个显著的应用实例是Gopaulchan等人的工作，他们分析了天然可可豆发酵过程，并重建了一个确定的微生物群落以提高发酵质量。这个工程化的群落促进了优质巧克力风味特征的发展，优于大宗可可豆的特性，展示了基于天然发酵过程建模的重组、功能性设计微生物群落的潜力。
尽管天然微生物组的“黑箱”移植在某些治疗和环境应用中显示出前景，但此类方法通常缺乏可扩展性和机制透明度。因此，一种混合策略——利用天然群落的生态鲁棒性与合成系统的可调性——可能在基础研究和生物技术创新中提供最有效的前进道路。
然而，微生物群落（无论是确定的、富集的还是为性能优化的）的有效使用，取决于能否以最小扰动存储它们，以便未来的分发和应用。对小型的、即用型群落的低温保存研究，以及低温保护剂对长期储存影响的研究表明，功能和组成的恢复都是可以实现的。然而，确保解冻后一致的群落组成和功能可能需要针对特定群落优化储存条件。用于研究和生物技术应用的保存微生物群落的广泛可用性，还将取决于ATCC和DSMZ等保藏中心为微生物群落提供适当的存储和分发服务——这些服务目前是有限的，特别是对于预混合的群落。
工程化微生物群落涌现功能的策略
工程化微生物群落能够通过成熟的设计-构建-测试-学习范式来微调涌现功能。已开发了计算机方法以支持群落设计并预测功能结果。例如，Melkonian等人使用基因组尺度代谢模型来证明嗜热链球菌Streptococcus thermophilus的氮交叉喂养如何影响奶酪群落中乳球菌属Lactococcus菌株的生长，并间接增强风味形成。优化群落水平功能的策略可大致分为三类：跨物种分配功能模块、通过合成生态学工程化群落组成以及进行原位基因编辑。
将生物合成途径作为功能模块分配给多个物种可以减少细胞负担并提高过程效率，这在将木脂素生物合成分配给两种酵母菌株的研究中得到了证明。共培养也用于减轻中间体毒性、升级循环副产物、通过区室化减少代谢干扰以及诱导生物合成基因表达。例如，Wei等人工程化了一个合成的三物种群落，其中谷氨酸棒杆菌C. glutamicum提供前体氨基酸，解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica提供前体脂肪酸给工程化的枯草芽孢杆菌B. subtilis，导致芬芥素产量比单一培养增加了约3.5倍。
在合成群落中，微生物可被视为具有广泛兼容的分泌代谢物的即插即用代谢模块。为了提高光合生物与多种伙伴的兼容性，对S. elongatus进行了工程化，使其将CO2转化为甘油，相对于CO2转化为葡萄糖的菌株，能量封存增加了3.2倍，并将日碳固定量提高了60%。共培养还可以释放难以单独培养物种的生物技术潜力。例如，厌氧菌普拉梭菌Faecalibacterium prausnitzii只有在与共分离的狄氏副拟杆菌Desulfovibrio piger共培养时才成功被开发为益生菌，后者增加了氧耐受性，并实现了为期两周的储存，且活力损失最小，而原始菌株的活力损失为97%。
工程化合成生态学的一种方法是利用营养缺陷型来创建稳定的、专性互利群落。这种营养缺陷型可以通过共培养期间产生的代谢副产物天然互补，从而形成交叉喂养群落。这种策略通过防止竞争排斥促进菌株共存。然而，天然互补的营养缺陷型可能在目标群落中不存在，因此通常需要基因工程。例如，Park等人工程化了由互补的营养缺陷型解脂耶氏酵母菌株组成的专性互利群落，这些菌株可以是同一物种内，也可以与S. cerevisiae组合，并利用群落稳定性来分配用于生产3-羟基丙酸的生物合成途径。这种方法使产物滴度比单一培养提高了40.3倍和18.6倍，浓度超过4毫摩尔。类似的策略被用于工程化一个四物种细菌群落中的交叉喂养，在体外和悉生小鼠中稳定了群落组成。
然而，成功的营养缺陷型互补需要适当的代谢物释放化学计量、群落组成和生长速率平衡，以维持集体生长。因此，可能需要进行多次工程迭代，正如Schito等人所展示的，他们工程化了亮氨酸和精氨酸营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌C. glutamicum菌株，实现了达到野生型菌株80%的共培养生长速率。
或者，可以利用专性营养缺陷型，通过去除必需代谢物在共同进化过程中诱导专性交叉喂养，选择分泌高成本代谢物。这些策略可以组合使用以实现更复杂的功能。例如，Rafieenia等人将基因工程和ALE应用于解脂耶氏酵母Y. lipolytica，产生了一个升级循环菌株，使其生物量增加了104%。在另一个案例中，通过ALE和基因改造工程化了一个细菌群落，使其在低pH下生产3.94克/升丁醇，比野生型群落提高了五倍。群落功能也可以通过筛选多样化微生物组装的组合空间、选择所需性状并重新组装以进行连续选择轮次来优化。使用这种方法，通过迭代选择合成群落，将有毒污染物的生物修复能力相对于先前研究的群落提高了69%。
尽管合成群落的成员通常作为分离物进行工程化，但也可以在天然或半天然群落内直接对特定菌株进行基因操作。例如，已通过CRISPR相关转座酶等工具，在群落中的特定细菌中进行了异源途径的基因组插入。例如，CRISPR-CAST已被用于灭活小鼠肠道微生物组中的毒性基因，并整合用于异源表达针对病原菌株的纳米抗体的基因。另一个用于体内编辑的基因工具是CRISPR碱基编辑器，它们已被包裹在噬菌体颗粒中，用于对小鼠肠道中E. coli的治疗性基因进行菌株特异性编辑。
最后，为了控制群落组成，可以在培养过程中操纵环境因素，创造不同的生态位。与流式细胞术或菌株特异性读数相结合的新型生物反应器原型已被用于调整营养源或温度，以维持不同群落成员之间的平衡。
未来展望
技术和基础研究的进步正在扩大对大量多样化微生物菌株的获取，共同实现了新颖的涌现功能。为了利用这一潜力，正在开发合成群落方法以实现类似于天然微生物组的鲁棒功能，这些功能在单一菌株中难以或无法实现。工业生物技术的某些领域特别有望从中受益。例如，发酵食品可以通过调节肠道微生物组和生理机能来促进人类健康，并且在增强风味、营养含量和功能益处（包括使用可持续的植物基底物）方面存在机遇。微生物群落还可能实现开放的、非无菌的发酵，从而降低生物生产的成本和环境影响。
基础研究在增加我们对微生物生态学的理解方面具有关键作用，以从“黑箱”微生物组方法转向更确定的合成生态学。尽管工程化微生物群落的工具正在进步，但基础知识——特别是关于精确群落工程所需的微生物相互作用——仍然有限。推进非模型微生物的功能基因组学，包括它们的遗传和生态相互作用，将有助于更好地理解和预测物种间的积极和消极相互作用。此外，根据有助于合成群落涌现功能的群落相关性状，对模式和非模型微生物进行调查，有助于为合成群落编目潜在的功能模块。最后，将“设计-构建-测试-学习”范式应用于微生物群落，为揭示合成微生物群落的设计原则提供了一种系统方法。
合成群落通常难以标准化，因为它们是为特定应用量身定制的，并允许多种菌株组合。然而，可以通过比较基于功能输出的群落来实现标准化和可重复性，包括制定储存标准。混合培养物储备可以使培养物保藏中心维护和分发特征功能菌株的“模式”群落，按应用领域编目。了解微生物组介导方法的稳定性和可扩展性，对于将基础研究转化为实际应用和推进技术就绪度至关重要。与此同时，监管环境必须应对合成群落的应用。虽然由普遍认为安全（GRAS）的菌株组成的群落可能为新颖功能提供可实现的途径，但基因工程化的群落可以增强性状，但将需要额外的监管监督。此外，在复杂的群落中可能需要更严格的监测，以减轻生物技术应用中潜在的危害性性状。
总体而言，合成群落提供了一种补充性——在某些情况下是替代性——的方法，以应对模式底盘范式，特别是在单一培养生物技术本身存在局限性的领域。
