高通量测序和代谢组学分析揭示了在酱香型白酒第四轮堆叠发酵前后，微生物、挥发性代谢物及游离脂肪酸的变化情况

《Food Chemistry》：High-throughput sequencing and metabolomics reveal changes in microorganisms, volatile metabolites, and free fatty acids in preceding and after the 4th round stacked fermentation of sauce-flavored baijiu

酱香型白酒第四轮叠酯发酵前后的微生物群落及挥发性代谢物动态研究，采用高通量测序和代谢组学技术，发现发酵前（P-SF）以细菌为主导，优势菌属包括Kroppenstedtia和Virgibacillus，后发酵（A-SF）真菌多样性显著提升，Monascus和Thermomyces活跃。挥发性代谢物中异丁酸、乙基癸酸、乙基己酸及2-甲基吡嗪等物质含量显著增加，关联微生物群落演替与环境因子（温度、酸度）驱动。脂肪酸分析显示游离脂肪酸特别是棕榈酸和亚油酸含量升高。

　　

张少基|林瑶|吴天翔|袁丹丹|姜守发|傅萍

贵州大学酒与食品工程学院，中国贵阳550025

摘要

堆叠发酵对酱香型白酒（SFB）品质的影响是多方面的。本研究重点关注第四轮堆叠发酵前的（P-SF）和发酵后的（A-SF）阶段。温度和酸度驱动了微生物的演替，其中Kroppenstedtia、Virgibacillus、Monascus和Thermomyces是主要属。在P-SF阶段，细菌群落占据了初始生态位，并具有较高的稳定性。在A-SF阶段，真菌群落表现出更大的多样性，其演替受到翻动随机性的影响。异戊酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量显著增加，增强了果香、花香和烤香。差异代谢网络揭示了关键中间体的合成途径，包括甘油、丙酸和丙二醇。堆叠发酵显著增加了游离脂肪酸的含量，尤其是棕榈酸和花生四烯酸。相关性分析进一步揭示了优势微生物与差异代谢物之间的潜在联系。本研究为SFB第四轮堆叠发酵的质量控制提供了有益的建议。

引言

酱香型白酒（SFB）作为十二种白酒风味类型之一，在中国因其独特的口味和香气而备受推崇（Chen, Wu等人，2022）。根据《中国酱香型白酒行业报告》的数据，SFB的销售收入将在2024年达到2400亿元人民币，显示出巨大的市场潜力。SFB的生产周期为一年，包括九轮蒸煮、八轮发酵和七轮蒸馏等传统工艺（Zhang等人，2024）。每轮发酵分为两个阶段：堆叠发酵和窖池发酵。堆叠发酵在露天车间进行，持续时间根据环境条件不同为2至11天（Chen等人，2024）。随后，发酵后的谷物被转移到窖池中进行厌氧发酵。在此过程中，微生物参与各种生理代谢途径，产生多种挥发性代谢物，包括酯类、醇类和萜类，这些物质直接影响白酒的感官品质（Yang, Xian等人，2023）。因此，堆叠发酵阶段不仅自发地捕获和丰富了环境中的微生物，还为后续的窖池发酵提供了重要的底物和风味前体，是SFB酿造过程中不可或缺的核心步骤。

近年来，关于SFB多轮堆叠发酵的研究日益深入。第一至第二轮（Xiao Hui）和第六至第七轮（Zhui Zao）基酒的质量不足归因于特定的微生物生态失衡。在第二轮堆叠发酵中，以Burkholderia为代表的菌株具有较高的代谢活性，消耗大量还原糖并产生酸性物质，导致发酵谷物中酸度过早积累，为基酒的酸涩风味奠定了基础（Chen等人，2024）。相反，在第六至第七轮堆叠发酵中，发酵谷物中的营养物质几乎耗尽，同时细菌群落中变形菌的比例异常增加（Wang等人，2021）。这种微生物失调可能与酒体的烧焦风味和品质下降有关。相比之下，第三至第五轮（Da Hui）的基酒占总基酒产量的超过一半，并具有最佳品质（Chen, Wu等人，2022）。研究发现，即使在Da Hui轮次内，温度升高的车间中Saccharomycetales的数量也较多，总风味化合物含量显著增加（Niu等人，2025）。上述研究从两个维度揭示了第三至第五轮（Da Hui）酒体卓越品质的科学依据：不同轮次之间的差异和空间异质性。然而，第四轮堆叠发酵是Da Hui阶段的关键时期，其特征是微生物多样性高和风味形成强烈。目前，关于这一阶段前后变化的研究相对较少。

因此，本文结合高通量测序（HTS）和代谢组学技术，研究了SFB第四轮堆叠发酵前（P-SF）和发酵后（A-SF）的微生物和挥发性代谢物。HTS用于研究堆叠发酵过程中的微生物多样性、群落结构和功能，并通过共线网络和β-最近分类单元指数（βNTI）对优势细菌和真菌进行了详细分析。HS-SPME-GC–MS用于分析挥发性代谢物。多元统计方法用于识别差异代谢物，KGEE数据库用于初步绘制主要差异代谢物的代谢途径。此外，基于代谢途径的特点，进一步分析了P-SF和A-SF中脂肪酸的差异。最后，通过Spearman相关性分析探讨了优势微生物属与差异代谢物之间的潜在相互作用关系。这些发现为第四轮堆叠发酵前后的情况提供了理论见解，并为SFB的风味质量控制提供了科学依据。

样本采集

样本采集

本研究在第四轮堆叠发酵过程中采集了两个不同阶段的样本（P-SF和A-SF）。采样日期分别为2024年5月5日和5月10日，所有样本均来自贵州贵酒集团有限公司（中国贵阳）。采样时，使用无菌取样器从锥形堆的上下层各提取500克样品进行混合。样品随后放入带有标记的无菌袋中，并储存在-20°C的环境中。

HTS数据概述

高通量测序结果见表S1。测序使用Illumina MiSeq平台完成，共获得244,892,049个原始碱基和745,143个原始读段。经过质量控制和组装后，使用Vsearch对序列进行聚类。细菌群落获得了588个有效操作分类单元（OTUs），真菌群落获得了503个有效OTUs。

结论

本研究聚焦于SFB的第四轮堆叠发酵过程。该过程由大曲和环境微生物共同调控，主要涉及的微生物包括Kroppenstedtia、Virgibacillus、Oceanobacillus、Monascus、Thermomyces和Saccharomycopsis。温度和酸度的变化驱动了微生物群落的演替。在P-SF阶段，细菌群落稳定性较高，占据了初始生态位并主导了发酵过程。在A-SF阶段，真菌群落表现出

CRediT作者贡献声明

张少基：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，方法学研究，调查分析，数据分析。林瑶：撰写 – 审稿与编辑。吴天翔：撰写 – 审稿与编辑，验证，项目监督，资金筹集。袁丹丹：撰写 – 审稿与编辑。姜守发：撰写 – 审稿与编辑。傅萍：资源协调，调查支持。

未引用参考文献

Yang等人，2023

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了贵阳酿酒厂酱油型白酒转化项目（项目编号30010102）的支持。