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海藻毒素AZA的物种分化和地理分布研究基于中国海域600份eDNA样本，采用PacBio HiFi长读测序技术分析ITS1–5.8S–ITS2和LSU（D1–D2）片段，构建Amphidomataceae参考数据库，划分17种已知和27种新疑似物种，揭示四类AZA产生种的分布特征及生态位分化，提出高分辨监测框架。
崔立新|胡文佳|乌尔班·蒂尔曼|岩崎光纪|陈一萌|康建华|许庆顺|哈拉·F·穆罕默德|卢欣欣|罗兆和
哈尔滨师范大学生命科学技术学院，中国哈尔滨
摘要
准确的物种鉴定对于追踪毒素来源、了解藻华动态以及改进监测工作至关重要。然而，短读长序列宏条形码技术在识别亲缘关系密切的有害微藻时往往缺乏分辨率。我们对来自中国海域的600个环境DNA（eDNA）样本进行了PacBio HiFi长读长序列宏条形码分析，这些样本覆盖了约40°的纬度范围（2019–2024年）。通过使用可复制的QIIME 2工作流程、精心整理的Amphidomataceae参考数据库以及物种鉴定标准（p-distance = 0.040对于Azadinium属；0.045对于Amphidoma属），我们识别出了44个Amphidomataceae谱系（17个已命名物种，27个潜在新分类单元），并绘制了它们的精细地理分布图。四种产生azaspiracids（AZAs）的物种表现出不同的分布特征：Az. dexteroporum主要分布在东海和南海的温暖咸水海域；Am. languida局限于黄海和长江口的温带近岸区域；Az. poporum主要分布在近岸区域，并存在不同的核糖型（B型和C型广泛存在）；而Az. spinosum则广泛分布于东海和南海，以核糖型A型和B型为主。通过生态位指标以及海表温度（SST）、盐度和营养指数（TRIX）的聚类分析，我们确定了三个生态群落，这些结果与MaxEnt模型预测的栖息地适宜性一致。可能的AZAs来源分别是渤海/黄海的Am. languida和Az. poporum，以及东海/南海的Az. dexteroporum、Az. poporum和Az. spinosum。HiFi长读长序列宏条形码技术揭示了隐藏的物种多样性，增强了风险评估能力，并为全球有害微藻的物种和亚种水平映射提供了一个可复制、可扩展的框架。
引言
有害藻华（HABs）对海洋生态系统、渔业和公共卫生构成了严重威胁（Anderson等人，2021年；Dai等人，2023年）。有效的管理需要物种级别的鉴定，因为亲缘关系密切的分类单元在毒素特征、藻华动态和生态影响方面可能存在差异（Kang等人，2025年；Yu等人，2023年）。尽管基于形态学的方法为该领域奠定了基础，但它们耗时较长，需要专家进行分类鉴定，且对于小型或隐秘物种尤其具有挑战性。
环境DNA（eDNA）宏条形码技术显著改变了常规监测方式，然而针对SSU rDNA片段的短读长序列分析（如V4、V9）通常缺乏物种级别的分辨率，尤其是在有害甲藻类群中（Sanders和Lin，2025年）。更具变异性的标记物，如内部转录间隔区（ITS）和LSU rDNA的D1–D2域，可以区分同属物种，在某些情况下甚至能区分种内谱系（Chai等人，2018年；Sildever等人，2019年）。然而，这些标记物的长度超出了大多数短读长序列平台的读取能力，限制了可靠的分类鉴定和稳健的系统发育推断。最近的研究建议将ITS与LSU结合使用，理想情况下使用完整的SSU–ITS–LSU区域来提高分辨率（He等人，2023年；Tillmann等人，2025年），但短读长序列NGS技术很少能够捕获这些全长目标。PacBio HiFi长读长序列技术现在能够准确恢复完整的ITS–LSU（以及SSU）条形码，尽管如此，其在有害微藻中的应用仍然有限（Lin等人，2025年）。
甲藻科Amphidomataceae（包括Azadinium Elbr?chter和Amphidoma Stein属）包含产生azaspiracids（AZAs）的物种，这些毒素是导致azaspiracid中毒（AZP）的原因（Tillmann等人，2009年；Twiner等人，2008年）。大多数Amphidomataceae成员的大小小于20微米，其细胞结构较为微小，难以在光学显微镜下检测到，分离也非常困难（Tillmann，2018a）。目前公认的产azaspiracids的物种有四种：Az. spinosum Elbr?chter和Tillmann，Az. poporum Tillmann和Elbr?chter，Az. dexteroporum Percopo和Zingone，以及Am. languida Tillmann和Salas Elbr?chter，此外全球还描述了许多非产毒物种/菌株（Tillmann，2018a）。该科的分类学进展迅速，目前全球已确认19种Azadinium和14种Amphidoma（Halldal，1953年；Kofoid和Michener，1911年；Kuwata等人，2025年；Kuwata等人，2024b年；Luo等人，2013年；Stein，1883年；Tillmann，2018a年；Tillmann等人，2025年；Tillmann等人，2026年）。然而，在亚太地区仍有许多物种尚未得到充分描述或特征不明确，它们的生物地理分布也仍在研究中。
在中国，通过 cyst萌发、形态分析和rRNA系统发育研究，从沿海沉积物中鉴定了三种物种：Az. dalianense Z.Luo、H.Gu和Tillmann，Az. zhuanum Z.Luo、Tillmann和H.Gu，以及Az. poporum。但只有Az. poporum通过LC-MS/MS方法被证实具有毒性（Gu等人，2013年；Luo等人，2013年；Luo等人，2017年）。尽管在多个沿海省份的贝类中检测到了AZAs（Wu等人，2014年；Wu等人，2015年），但直接的水柱记录和培养的Amphidomataceae菌株仍然很少，这既反映了检测微小细胞的难度，也反映了短读长序列分析的分辨率限制。针对性的分子工具有助于弥补这一差距：qPCR检测可以即使在低丰度下也能识别特定的AZAs产生菌株（Az. spinosum、Az. poporum、Am. languida）（Toebe等人，2013年；Wietkamp等人，2020年；Wietkamp等人，2019a年；Wietkamp等人，2019b年），而短扩增子ITS/LSU宏条形码技术也揭示了意外的物种多样性（例如在台湾海峡地区；Liu等人，2023年）。然而，短读长序列方法常常会将亲缘关系密切的物种或核糖型合并，从而掩盖生态模式并阻碍AZAs来源的确定（He等人，2023年）。
在这里，我们使用PacBio HiFi长读长序列技术对2019至2024年间从中国沿海海域收集的600个eDNA样本进行了ITS1–5.8S–ITS2和LSU（D1–D2）区域的分析。我们的目标是：（i）优化适用于整个ITS–LSU标记的通用引物组合，并实现基于QIIME 2的工作流程；（ii）整理Amphidomataceae参考数据库；（iii）利用系统发育关系和属特异性p距离阈值来界定物种。在此基础上，我们进一步（iv）绘制了精细的空间分布图；（v）量化生态位广度和重叠度（Levins的B2，Schoener的D）；（vi）为AZAs产生菌株提供一级栖息地适宜性评估。这一框架将有害藻华研究从属级筛选提升到了物种和亚种级别的生态学研究，从而能够更精确地识别毒素来源，并在中国沿海地区实施基于证据的监测。
样本采集
2019年至2024年间，我们在中国沿海水域收集了600个海水样本，覆盖了大约40°的纬度和15°的经度范围，涵盖了从温带到热带的各种气候带，包括渤海、黄海、东海、台湾海峡和南海（图1；表S1）。选择采样点时考虑了河口、近岸以及大陆架/远海栖息地。大多数站点会定期重复采样以增加数据量
长读长序列扩增子测序概述
PacBio测序产生了来自600个海水样本的25,421,354个HiFi读长序列（平均每个样本42,369个读长）。经过与Amphidomataceae参考数据库的比对和NCBI BLAST验证后，有4,899个读长被可靠地归类为Amphidomataceae：2,762个属于Azadinium属，2,137个属于Amphidoma属。大多数被归类的读长（3,936个）具有超过99%的序列一致性，实现了直接的物种级别鉴定。这些样本包括13种Azadinium属物种，其中Az. anteroporum
中国海域中Amphidomataceae的多样性
Amphidomataceae成员主要为非常微小的细胞（<20微米），其细微的细胞结构特征阻碍了常规的鉴定和分离（Tillmann，2018a）。在发现几种物种能产生AZAs后，人们对这一类的兴趣显著增加，这些毒素会在贝类中积累并对公共卫生构成重大威胁（Krock等人，2019年；Twiner等人，2008年）。我们的系统发育分析基于完整的ITS1–5.8S–ITS2和部分LSU（D1–D2）rDNA HiFi读长序列，进一步证实了之前的研究结果CRediT作者贡献声明
崔立新：数据整理、研究、方法论、软件开发、数据可视化、初稿撰写。胡文佳：软件开发、数据整理、数据分析、审稿与编辑。乌尔班·蒂尔曼：监督、数据验证、撰写、审稿与编辑。岩崎光纪：监督、数据验证、撰写、审稿与编辑。陈一萌：数据整理、资源获取。康建华：监督、数据验证、撰写、审稿与编辑。许庆顺：监督、数据验证、撰写、审稿与
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崔立新：初稿撰写、数据可视化、软件开发、方法论研究、数据整理。胡文佳：审稿与编辑、软件开发、数据分析。乌尔班·蒂尔曼：撰写、审稿与编辑、监督。岩崎光纪：撰写、审稿与编辑、数据验证。陈一萌：资源获取、数据整理。康建华：撰写、审稿与编辑、监督。许庆顺：撰写、审稿与编辑、数据验证，
