综述：宿主来源的miRNA作为猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的新调控因子：机制机制洞察与治疗潜力

《International Journal of Biological Macromolecules》：Host-derived miRNAs as novel regulators of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication: Mechanistic insights and therapeutic potentials

卵巢衰老与铁死亡、氧化应激及细胞骨架解体相关，本研究通过小鼠模型和D-半乳糖诱导的KGN细胞，发现中强度静磁场（100 mT）通过激活NRF2/TERT/ACSL4通路抑制铁死亡并重塑F-actin细胞骨架，从而延缓卵巢衰老。

　　

陈亚欣|张静|崔双双|张伟|徐晨毅|程慧如|张雷|刘亚静|张欣|尹宗志|曹云霞|梁丹|余彪

安徽医科大学第一附属医院妇产科，国家卫生健康委员会异常配子和生殖道研究重点实验室，中国安徽合肥230022

摘要

卵巢衰老是女性生殖能力下降的主要因素，与氧化应激、铁死亡（ferroptosis）和细胞骨架紊乱有关。然而，调控卵巢衰老过程中铁死亡机制的治疗策略仍不够明确。本研究探讨了NRF2/TERT/ACSL4信号轴在卵巢衰老过程中对铁死亡调控和细胞骨架重塑的作用，并探索了中等强度静态磁场（SMF，100 mT）作为非药物干预手段激活NRF2信号传导的潜在疗效。通过使用自然衰老的雌性小鼠和D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老颗粒膜细胞（KGN细胞），结合组织学、生化、线粒体和分子分析，以及使用NRF2调节剂（包括ML385和SFN）和端粒酶抑制剂（BIBR1532）进行药理学验证，阐明了相关机制。研究发现，SMF通过激活NRF2/TERT/ACSL4轴显著减轻了卵巢衰老和D-半乳糖诱导的衰老，从而维持了细胞内铁稳态，抑制了铁死亡损伤，并恢复了F-肌动蛋白细胞骨架的有序结构。机制上，NRF2直接结合并上调TERT的表达，其Glu79位点对于NRF2依赖性的TERT调控至关重要。进一步分析表明，磷酸化的p62在Ser349位点与KEAP1的Arg483位点竞争性结合，促进NRF2的解离和激活，而SMF暴露则作为外部触发因素促进了这些分子事件。总之，激活NRF2/TERT/ACSL4信号轴通过协调铁死亡抑制和细胞骨架重塑，构成了对抗卵巢衰老的核心保护机制。针对这一途径的生物物理干预（如静态磁场暴露）可能有助于延缓卵巢功能的衰退。

引言

卵巢衰老是全身衰老的早期迹象之一，会导致卵泡数量和质量的逐渐下降，从而降低生育能力、引发激素失衡并增加与年龄相关的健康风险[1]。这一过程通常在30岁左右开始，并在绝经前加速。随着全球推迟生育的趋势，迫切需要了解其潜在机制并开发安全有效的干预措施[2]。主要因素包括氧化应激、线粒体功能障碍、慢性炎症和程序性细胞死亡[3]。由于抗氧化防御能力有限，颗粒膜细胞和卵母细胞特别容易受到ROS的损伤，这会破坏线粒体功能，影响卵泡发生并降低卵母细胞质量和激素分泌[4],[5],[6]。

核因子红系相关因子2（NRF2）是氧化稳态的核心调节因子。NRF2的活性主要受到Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）的抑制，后者促进NRF2的蛋白酶体降解并阻止其核转位[7]。值得注意的是，自噬适配蛋白SQSTM1/p62（在人类中位于Ser349位点，在小鼠中为Ser351位点）与KEAP1高亲和力结合，这种相互作用促进KEAP1被隔离到自噬体中进行降解，破坏KEAP1-NRF2复合体，从而促进NRF2的积累和激活[8],[9]。因此，NRF2的激活可上调抗氧化基因（如HO-1、GPX4和xCT）的表达，减少ROS和脂质过氧化，这与研究表明小分子可以在多种生物学背景下调节代谢酶一致[10],[11]。在卵巢中，NRF2缺乏会加速衰老和卵泡丢失，而其激活则能保护卵巢免受氧化损伤[12],[13]。端粒酶逆转录酶（TERT）作为端粒酶的催化亚基，维持端粒长度并支持线粒体功能和细胞存活[14]。TERT活性降低与颗粒膜细胞衰老和卵泡发生障碍相关[15]，NRF2可能通过转录调控TERT，表明两者在维持卵巢功能中存在相互作用[16]。由脂质过氧化驱动的铁死亡也促进了卵巢衰老[17]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）是铁死亡的关键酶，它促进氧化损伤，而NRF2则可以抵消这种效应，表明这两种途径之间的平衡至关重要[18]。此外，细胞骨架的完整性，特别是F-肌动蛋白的有序结构，对卵母细胞的极性、减数分裂和颗粒膜细胞功能至关重要。细胞骨架的破坏与衰老卵巢中卵母细胞的能力和卵泡发育障碍有关[19],[20]。F-肌动蛋白动态对氧化应激敏感，有证据表明NRF2和TERT可能通过基因组和非基因组机制维持细胞骨架结构。目前的治疗方法（如激素替代疗法、干细胞疗法和抗氧化剂）存在安全性风险和高成本等局限性，因此需要更安全、更易获得的替代方案[21]。

静态磁场（SMF）是指强度和方向随时间不变的磁场，最近作为一种调节生理过程的生物物理方法受到了关注。根据强度，SMF分为弱场（<1 mT）、中场（1 mT–1 T）和强场（>1 T）[22]。中场强度的SMF（通常约为100–600 mT）因其安全性和生物活性而备受关注[20]。研究表明，SMF可以影响细胞增殖、线粒体功能和氧化还原平衡。在代谢和衰老研究中，SMF可以改善葡萄糖和脂质紊乱，减少炎症，并延缓动物模型中的衰老表型[23],[24],[25],[26],[27]。在雄性小鼠中，长期暴露于中等强度的SMF可以延长寿命并改善全身代谢稳态[27]。此外，多项研究表明SMF可以影响生殖细胞的发育。例如，SMF可以影响猪卵泡和小鼠卵母细胞的成熟，但这些效应高度依赖于场强、暴露时间和方向等参数[28],[29]。尽管有这些发现，但SMF在女性生殖衰老中的应用仍研究不足。目前尚不清楚SMF如何影响卵巢衰老过程中的铁死亡、氧化应激和细胞骨架重塑。鉴于SMF的安全性、无侵入性和渗透性，探索其在卵巢衰老中的治疗潜力具有新颖性和临床意义。

在本研究中，我们探讨了NRF2/TERT/ACSL4信号轴的调节如何通过影响铁死亡和细胞骨架重塑来对抗卵巢衰老。利用自然衰老的雌性小鼠和D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老KGN细胞，我们研究了该信号通路的激活如何影响卵巢结构、卵泡发育、氧化应激和细胞衰老。我们使用中等强度的静态磁场（SMF，100 mT）作为非药物手段激活NRF2信号传导，从而探究下游的分子事件。我们假设NRF2的激活上调TERT表达并抑制ACSL4，从而抑制铁死亡并稳定F-肌动蛋白细胞骨架结构。从机制上讲，我们认为磷酸化的p62（Ser349位点）与KEAP1竞争性结合，促进NRF2的解离和核转位。研究结果表明，激活NRF2/TERT/ACSL4轴是抵御卵巢衰老的核心机制，而针对性的生物物理刺激（如SMF暴露）可能是一种有前景的非侵入性策略，有助于维护女性生殖健康。

化学物质和试剂

本研究中使用的抗体如下：Anti-PCNA（Cat# 13110）和Anti-Ki-67（Cat# 9129）购自Cell Signaling Technology（CST，美国）；Anti-SQSTM1/p62（Cat# ab91526）购自Abcam（英国）；Anti-TERT（Cat# 27586–1-AP）、Anti-NRF2（Cat# 16396–1-AP）和Anti-ACSL4（Cat# 22401–1-AP）购自Proteintech（武汉，中国）；Anti-ACSL4（Cat# YM8287）、Anti-AMH（Cat# YN2305）、Anti-p21（Cat# YM8364）、Anti-p53（Cat# YM8533）、Anti-SQSTM1/p62（Phospho Ser349，Cat#

SMF通过增强卵巢功能来延缓卵巢衰老，具有可接受的生物安全性

先前的研究表明，100 mT的SMF暴露对自然衰老的雄性小鼠具有保护作用[27]。为了评估类似益处是否也适用于卵巢衰老，我们将自然衰老的雌性小鼠暴露于向上或向下的SMF（SMF#1和SMF#2）或对照组（图1A，B）。安全性评估包括主要器官的组织学检查和血液学分析，结果显示外周血参数没有显著变化（图S1和S2）。

SMF治疗

讨论

卵巢衰老表现为卵泡数量和质量的逐渐下降，卵母细胞质量下降以及卵巢微环境的破坏，这是女性生殖健康面临的关键挑战。越来越多的证据表明，氧化应激、端粒缩短和铁死亡是这一过程的关键因素[17],[45],[46]。本研究提供了新的机制见解，表明SMF通过促进磷酸化p62介导的KEAP1/NRF2解离来延缓卵巢衰老

结论

总之，我们的研究发现了SMF延缓卵巢衰老的新机制。在自然衰老的雌性小鼠中，长期暴露于SMF改善了卵巢形态和功能，同时减少了间质纤维化并改善了氧化还原状态。机制上，SMF增强了p-p62-Ser349与KEAP1的结合，并依赖于KEAP1的Arg483位点来促进NRF2的解离和激活。值得注意的是，一种药理学上的KEAP1–NRF2相互作用抑制剂

缩写

D-gal
D-半乳糖
KGN
人颗粒膜细胞肿瘤来源的KGN细胞系
NRF2
核因子红系相关因子2
TERT
端粒酶逆转录酶
ACSL4
酰基辅酶A合成酶长链家族成员4
SMF
静态磁场
Glu79
甘氨酸第79位
p62
Sequestosome 1
Ser349
丝氨酸第349位
Arg483
精氨酸第483位
KEAP1
Kelch样ECH相关蛋白1
F-actin
丝状肌动蛋白
ROS
活性氧
Ser351
丝氨酸第351位
HO-1
血红素加氧酶1
GPX4
谷胱甘肽过氧化物酶4

CRediT作者贡献声明

陈亚欣：撰写——原始稿件、方法学、数据管理、概念构思。张静：撰写——原始稿件、方法学、数据管理、概念构思。崔双双：软件操作、方法学、实验设计、数据管理。张伟：软件操作、方法学、实验设计、数据管理。徐晨毅：软件操作、方法学、实验设计、数据管理。程慧如：验证、实验设计。张雷：验证、实验设计。刘亚静：撰写——审稿与编辑、验证

伦理批准和参与同意

本研究遵循美国国立卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物，第8版，2011年）进行。此外，实验程序获得了安徽医科大学实验室动物科学协会的批准（LLSC20241895）。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（82501986）、安徽省自然科学基金青年项目（2508085QE176）、安徽省优秀青年自然科学基金项目（2508085Y045）和安徽省高校重点科研项目基金（2024AH050713）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢安徽医科大学异常配子和生殖道研究重点实验室对这项研究的支持。同时感谢合肥海业健康科技有限公司（中国湖州）为实验提供磁场支持，以及张成宇和张淑瑶在实验协助和卡通插图制作方面的帮助。