《Journal of Proteome Research》：Salivary Proteomics Reveals Oxidative Markers in E-Cigarette Users
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本文通过唾液蛋白质组学分析，首次系统揭示了电子烟（e-cigs）使用者口腔内发生了显著的生物学改变。研究发现电子烟暴露导致22种唾液蛋白丰度发生显著差异，其中过氧化物还原酶-1（PRDX1）等氧化应激相关蛋白上调，提示口腔环境存在氧化应激反应。同时，功能富集分析显示差异蛋白显著富集于角质化、角质形成细胞分化等与上皮完整性和细胞防御相关的通路。研究还观察到电子烟使用者的唾液粘度降低、可替宁浓度升高，表明口腔内环境稳态受到干扰。这些发现为理解电子烟对口腔健康的潜在危害提供了新的分子证据，强调了长期监测和公众教育的必要性。
引言
电子尼古丁传送系统（ENDS），通常被称为电子烟或电子雾化器，其使用已构成一个影响深远的全球公共卫生问题。这些设备作为传统卷烟的替代品出现，其消费量，尤其是在年轻人中，近年来呈指数级增长。电子烟的流行和高社会接受度归因于其使用美味且气味愉悦的调味剂，以及将其宣传为现代且安全的营销手段。使用电子烟辅助戒烟是一个极具争议的话题。然而，科学证据已经表明，除了在此过程中效率不高且会增加尼古丁依赖外，它们也不像先前认为的那样对健康无害。其烟油通常由水、调味剂、不同浓度的尼古丁、丙二醇和植物甘油混合而成。这些产品还可能含有被认为是细胞毒性或致癌的物质，包括亚硝胺、重金属、甲醛、乙醛、丙烯醛、多环芳烃和丙酮。吸入这些化合物会对呼吸系统和心血管系统以及口腔黏膜和唾液产生有害影响。
唾液是一种由水、蛋白质、无机物和有机物组成的生物流体。唾液功能降低会导致多种口腔健康问题，包括吞咽和说话困难、龋齿风险增加、口腔黏膜病变、机会性真菌感染和牙周病。唾液不仅是一种复杂且多功能的生物流体，而且易于收集、无创、成本低，并且相对易于运输和储存。唾液样本已允许识别多种疾病，包括口腔鳞状细胞癌。在这方面，也已描述了关于传统烟草和水烟的有害、炎症和氧化应激的有前景的生物标志物。它含有超过2000种蛋白质和多肽，涉及口腔内的各种生物学功能。识别和量化这些蛋白质可以提高提供更特异性诊断和预后的能力，有助于选择最佳个体化治疗并监测患者反应。因此，本研究的目的是分析电子烟使用者与对照组之间唾液蛋白质组谱的差异。此外，该研究旨在调查使用电子烟个体可能的唾液改变。
结果
参与者人口统计学和基线特征
本研究利用了与我们之前对电子烟使用者的代谢组学研究相同的参与者队列。参与者特征，包括人口统计学变量和与电子烟相关的行为，已在别处描述并在补充表格S1和S2中总结。研究人群主要由男性（56%）组成，平均年龄约为26-27岁。两组表现出可比的人口学特征，以自我报告的白人参与者为主，且教育水平较高。与对照组相比，电子烟组表现出更高水平的呼出一氧化碳（2.12 ± 1.59；p= 0.015）和降低的外周血氧饱和度（96.76 ± 1.23；p= 0.036）。关于酒精饮料消费情况，电子烟组的结果更高。尽管两组的总体AUDIT（酒精使用障碍识别测试）平均得分仍处于“低风险”类别，但电子烟组的平均值几乎是对照组观察到的两倍（p= 0.003）。在比较平均酒精消费量时，观察到电子烟组消费量明显更高的模式，对照组40%的参与者消费1-2个剂量，而电子烟组40%的参与者至少消费3-4个剂量。
唾液分析
唾液测量显示，电子烟组的粘度值较低（2.04 ± 1.33；p= 0.048），并且可替宁水平明显高于对照组。对于其余分析的唾液参数，未观察到统计学上的显著差异。
电子烟使用情况
电子烟组的使用模式详见表S2。电子烟组的参与者已使用该设备大约2.13年。在该组中，52%的个体每日使用，60%的个体每天使用设备7次到10次以上。果味/甜味调味剂是最常被选择的，其次是薄荷味。关于剂量，观察到的平均尼古丁浓度为37.2 mg/mL，这是一个被认为非常高的值。一个相关发现涉及电子烟和酒精的关联。大约76%的参与者报告同时使用酒精饮料和电子烟。此外，52%的人表示饮酒与设备使用频率增加有关。
蛋白质组学分析
总共鉴定出1773种蛋白质。正如数据依赖性采集蛋白质组学所预期的那样，在所有样本中观察到了高比例的缺失值，反映了随机前体选择和低丰度蛋白质的有限可检测性。考虑到我们数据集中缺失值的主导地位和变异性，插补会对下游统计分析产生不成比例的影响，并可能人为地驱动组间差异。因此，我们选择了一种更严格的过滤策略，优先考虑稳健性和可解释性，而不是蛋白质组覆盖度。虽然这减少了保留的蛋白质总数，但它最大限度地降低了插补驱动假象的风险，并确保报告的结果基于一致观察到的定量测量。因此，经过数据处理和过滤（即考虑在每个实验组所有受试者中均鉴定出的蛋白质），92种蛋白质在电子烟组和对照组中均显示出定量值。2-transformed intensity values for the 92 proteins shared by all subject from EG (red) and CG (blue)."> 通过Wilcoxon-Mann-Whitney检验评估组间差异，该检验独立应用于每种蛋白质。总共有22种蛋白质被发现具有统计学显著性（p≤ 0.05）。如图2A的网络图所示，与对照组相比，电子烟组唾液中丰度增加（up-regulation）的蛋白质占主导地位，其中过氧化物还原酶-1（Peroxiredoxin-1， Q06830）蛋白被突出显示。相反，少数蛋白质在电子烟组中丰度降低（down-regulation）。2(fold change) values from the 22 statistically significant proteins (Wilcoxon–Mann–Whitney test). (B) GO enrichment analysis (biological process) for the 22 statistically significant proteins."> 对这22种显著蛋白质的功能富集分析（图2B）表明，其对上皮完整性和细胞反应相关的通路有强烈影响。具有最高统计学显著性的通路是角质化（Keratinization）和角质形成细胞分化（Keratinocyte Differentiation），其次是表皮细胞分化（Epidermal Cell Differentiation）。应激反应（Stress Response）等通路涉及大量蛋白质，表明蛋白质变化集中在黏膜防御和结构形成过程中。22种差异丰度蛋白质的定量强度结果详见图3。对于大多数蛋白质，观察到电子烟组的表达显著高于对照组（p< 0.05）。p-value of the Wilcoxon–Mann–Whitney test (n= 22).">
讨论
唾液蛋白质组学
生物标志物被定义为可作为正常或病理生物学过程指标的可测量分子。分子标志物可以包括DNA、RNA、代谢物或蛋白质，可用于疾病的早期诊断、预后和分期。生物标志物分析提供了关于疾病机制和可能受影响的组织和系统的信息，并指出了患者的个体易感性。先前的研究已经探索了吸烟者、酗酒者以及使用可卡因等物质者的唾液蛋白质组。然而，迄今为止，尚无研究专门检查电子烟使用者的特定唾液蛋白质组。尽管存在某些局限性，例如参与者之间的饮食差异，但我们的研究团队是首批探索这一领域的团队之一。这项研究尤其重要，因为它有助于识别与电子烟使用相关的早期损害检测相关的蛋白质和潜在生物标志物。
电子烟本质上是一种由锂电池组成的设备，负责将调味剂加热到高温并产生用户吸入的气溶胶。这种气溶胶由丙二醇、甲醛、甘油、不同浓度的尼古丁和其他化合物等物质组成，其中许多在室温下或加热后表现出细胞毒性和致癌性。研究表明，电子烟调味剂中存在的成分在增加自由基产生方面起着重要作用，对用户构成潜在的毒理学风险，并影响先天免疫系统，增加感染风险。
鉴于需要了解短期细胞损伤以及电子烟的使用如何影响唾液中存在的蛋白质丰度，唾液蛋白质组学成为一个重要的研究领域。在两组中鉴定出的22种具有统计学显著性的蛋白质中，发现过氧化物还原酶-1（PRDX1）表达上调。其主要功能是保护细胞免受活性氧引起的氧化应激。PRDX1水平升高表明口腔环境中的氧化应激增加，这进一步挑战了电子烟是传统卷烟使用更安全替代品的误解。功能富集分析中观察到的应激反应通路的强烈代表性也得到了PRDX1增加的支持。
尽管与传统吸烟者相比，电子烟用户患口腔癌和口咽癌的风险似乎较低，但与电子烟相关的真正风险因素尚未明确确定。氧化DNA损伤是能够促进癌症发展的刺激因素之一。尽管PRDX1的存在并非电子烟使用者口腔鳞状细胞癌风险增加的直接指标，但这一发现突显了电子烟的有害影响，其长期影响仍未得到充分研究。
在研究中同样表达上调的膜联蛋白A3（ANXA3）成为一种潜在的生物标志物，在多种肿瘤中显示差异表达，并能够维持增殖、促进侵袭和转移以及诱导化疗耐药。然而，尽管它在风险分层和早期癌检测方面显示出显著的临床价值，但其临床潜力仍需要进一步研究，文献中没有发现描述与这种蛋白质存在相关的口腔恶性病变的报告。
氧化应激也是细胞防御和适应机制的有力信号。诸如envoplakin和SPRR3等角质形成细胞结构成分的蛋白质也上调。支持角质化和角质形成细胞分化等其他通路增加的细胞分化和保护过程，表明黏膜对这些组织所暴露的环境应激的反应。这可能代表了长期口腔健康改变的先兆。S100-A14的表达改变已在包括口腔鳞状细胞癌在内的多种人类恶性肿瘤中报道，突出了其在此背景下的相关性。一项研究表明，S100-A14在从正常细胞到不典型增生和癌的表型转变过程中表达逐渐降低，并且与对照细胞相比，其过表达可以抑制口腔鳞状细胞癌相关细胞系的增殖。
唾液改变
实验研究表明，与薄荷味或传统烟草味产品相比，甜味产品往往更具吸引力，并导致更高的暴露水平，这可能有助于增加使用频率和持续使用。唾液可替宁浓度升高表明尼古丁暴露量很大，这不仅会加剧依赖，还会增强生物膜形成和微生物活力。因此，本研究中参与者唾液中检测到的高可替宁浓度引发了关于电子烟对口腔健康潜在长期影响的严重担忧。
关于电子烟使用对使用者唾液特性影响的研究仍然很少。尽管在唾液流速、基线pH值或缓冲能力方面未发现组间差异，但观察到唾液粘度的变化。唾液粘度反映了唾液中粘蛋白的含量，这是保护和湿润口腔黏膜的重要因素。在本研究中，与对照组相比，电子烟组的粘度较低，这可能表明样本成分发生了变化。据我们所知，之前没有研究专门调查过这一方面。
唾液流速分析显示，与对照组相比，电子烟组的唾液流速值较低。这种减少可能与调味液中常见的化合物有关，例如丙二醇和甘油，它们已知会刺激上呼吸道并促进黏膜干燥。先前的研究报告称，传统卷烟的使用会降低唾液pH值，创造一个更酸性的口腔环境，有利于牙齿脱矿。在本研究中，未观察到组间唾液pH值的统计学显著差异；然而，电子烟使用者的平均pH值略高于非吸烟者，这强调需要进一步研究以更好地理解这些影响。
尽管越来越多的研究强调了与使用电子烟相关的风险，但显著的知识差距仍然存在。显然需要进行更多的研究和长期监测用户。然而，在广泛传播准确信息的同时，实施预防和教育措施的紧迫性仍然至关重要。
结论
本研究的结果表明，电子烟的使用会引发口腔环境中可测量的生物学改变。唾液蛋白质组的改变，以参与氧化应激和上皮分化的蛋白质上调为标志，表明了对气溶胶暴露的早期分子反应。唾液特性的改变，包括高可替宁水平和降低的粘度，进一步表明可能损害黏膜保护和整体口腔稳态的紊乱。总之，这些结果加强了对电子烟长期影响的担忧，这些影响仍未得到充分理解。同时，传播准确信息和预防指导对于反驳电子烟是无害替代品的观念仍然至关重要。
材料与方法
伦理方面
本研究获得了圣若泽杜斯坎普斯科技学院人类研究伦理委员会的批准。
参与者选择
便利样本根据预先设定的参数确定。根据Bonferroni校正，对于0.01的显著性水平和90%的检验效能，总样本量应为48名患者。因此，研究中的50名参与者被分配到两组：
- 1.
电子烟组：由25名规律且专一使用电子烟至少六个月的个体组成，口腔黏膜无可见临床改变。
- 2.
对照组：由25名不吸烟且不使用电子烟的个体组成，口腔黏膜无可见临床改变。
研究参与者于2022年1月至8月期间从圣若泽杜斯坎普斯、莫吉-达斯克鲁兹和然迪拉市招募。纳入标准要求个体至少年满18岁，提供书面知情同意书，并且无慢性全身性疾病史。对于电子烟组，资格还要求至少有两年戒烟史。排除标准包括同时使用传统卷烟和电子烟、正在接受自身免疫性疾病治疗、有慢性全身性疾病史或长期用药史、怀孕或哺乳，以及任何既往手术、化疗或放疗干预。
为确保无病变或感染，所有参与者均接受了口外和口内检查。通过测量心率、血氧饱和度、毛细血管血糖水平和呼出一氧化碳浓度来评估所有参与者的临床参数。
样本收集
指示参与者在样本收集前2小时内不要刷牙或进食，并在12小时内避免饮酒。为减少口腔碎屑，参与者在样本收集前用蒸馏水漱口1分钟。样本收集在预定时间段内进行，即上午9:00-11:00或餐后（下午2:00-4:00）。唾液收集在参与者直立坐在平静且通风良好的环境中进行。通过将未刺激唾液吐入无菌一次性塑料管中收集5分钟。样本立即置于冰上并运送到实验室。每个样本被分成等分试样并存储在-80°C下，直到进行进一步的蛋白质组学分析。
鸟枪法蛋白质组学分析
唾液样本首先在室温下解冻，涡旋10秒，然后在4°C下以14,000 rpm离心10分钟，以去除所有碎屑，包括不溶性物质、细胞碎片和食物颗粒。将上清液转移至新的微量离心管中，并添加细胞裂解缓冲液。使用5μL唾液样品、250μL Bradford试剂和牛血清白蛋白作为标准品，在96孔板上测定唾液蛋白浓度。使用595 nm分光光度计测量吸光度，并将数据导出到Microsoft Excel。根据标准曲线得出的线性方程，计算样品中的蛋白质浓度。
将100μg唾液蛋白部分与在50 mM HEPES中制备的盐酸胍混合，以达到3 M的终浓度。然后添加1,4-二硫苏糖醇至终浓度为5 mM，并将混合物在65°C下孵育1小时，以减少蛋白质中的二硫键。为了烷基化游离巯基，添加2-碘乙酰胺至终浓度为15 mM。样品在室温黑暗中孵育30分钟。孵育后，添加二硫苏糖醇至终浓度为15 mM，并将样品在室温下再孵育20分钟，以淬灭过量的碘乙酰胺。
为去除蛋白质变性步骤中的盐，通过添加8体积的-20°C丙酮和1体积的-20°C甲醇进行蛋白质沉淀。样品在-80°C孵育2小时。孵育后，将样品在4°C下以14,000g离心10分钟，并弃去上清液。用1体积甲醇洗涤沉淀，并再次在4°C下以14,000g离心10分钟。重复此洗涤步骤两次。在最终离心后，弃去上清液，并使沉淀在室温下风干。将蛋白质溶解在10μL 100 mM NaOH中。随后，添加80μL H2O和10μL 500 mM HEPES pH 7.5。最后，以1:100的酶-蛋白比添加胰蛋白酶，并将混合物在37°C下孵育过夜。
孵育后，添加甲酸至终浓度为5%以酸化样品并灭活胰蛋白酶。使用安装在P1000移液器吸头上的C18膜对肽样品进行脱盐。通过添加500μL甲醇，然后添加500μL Milli-Q水来平衡吸头。对于柱平衡，添加500μL 0.1%甲酸。膜准备好后，上样样品。脱盐后用0.1%甲酸洗涤两次。为了洗脱肽，用50%乙腈（含0.1%甲酸）洗涤柱两次，最后用100%乙腈洗涤以确保肽的完全洗脱。使用SpeedVac干燥脱盐后的样品。干燥后，使用BCA定量肽，并进行质谱分析。
质谱分析
样品在Orbitrap Exploris 480质谱仪上进行分析，该质谱仪与纳升级液相色谱仪nLC Vanquish Neo联用。使用5-30%的溶剂B梯度洗脱肽提取物75分钟，然后在7分钟内从30%升至40%的溶剂B，再在8分钟内从40%升至99%的溶剂B，流速为300 nL/min。电喷雾源在2.1 kV下运行。
通过以全MS模式获取光谱来分析肽混合物，用于MS1测定的分辨率为60,000。自动模式下的最大注入时间范围为400至1000 m/z。通过数据依赖性采集自动选择20个最强峰，使用FAIMS系统中配置的两个补偿电压（-45 V和-60 V）获取随后的MS/MS谱图。MS/MS谱图以30,000的分辨率、50 ms的最大注入时间获取。应用了30秒的动态排除。
生物信息学分析
从鸟枪法质谱仪获得的原始数据使用MaxQuant软件进行处理。蛋白质和肽-谱图匹配鉴定要求1%的错误发现率。数据针对限制在“Homo sapiens”分类群的靶向数据库进行搜索，并结合245种常见污染物的序列，并与所有序列的反向版本串联。酶特异性设置为胰蛋白酶，最多允许两个漏切位点；选择半胱氨酸氨基甲酰甲基化作为固定修饰，而选择蛋氨酸氧化、谷氨酰胺/天冬酰胺脱酰胺和蛋白质N末端乙酰化作为可变修饰。肽的鉴定基于7 ppm的初始质量偏差用于前体离子，片段质量容差设置为0.02 Da。使用MaxLFQ算法进行无标记定量，并在MaxQuant中启用“运行间匹配”功能。与脊椎动物等复杂蛋白质组一样，肽可以在同源蛋白质或剪接变体之间共享，导致“蛋白质组”的形成。在MaxQuant生成的“proteinGroups.txt”文件中，选择第一个蛋白质条目作为每个蛋白质组的代表。
将对应于已鉴定蛋白质的定量值取对数（以2为底），然后使用R/Bioconductor平台上可用的“preprocessCore”库进行分位数标准化。使用R/Bioconductor平台上同样可用的Limma库进行实验条件之间的比较分析。调整后的p值 ≤ 0.05且log2（倍数变化） > 1或 < -1的蛋白质被认为是差异表达的。
用于已鉴定蛋白质相关基因功能富集的软件是ShinyGO。使用标准参数，考虑FDR临界值 <0.05。
