《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide identification of raffinose synthase gene family in barley (Hordeum vulgare L.) reveals its role in multiple abiotic stress tolerance
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本文通过全基因组分析，在大麦 (Hordeum vulgare L.) 中系统鉴定了8个棉子糖合成酶 (Raffinose Synthase, RS) 基因 (HvRS)，并深入解析了其进化、结构和表达模式。研究发现，HvRS2和HvRS5在盐、干旱 (PEG模拟) 和脱落酸 (ABA) 胁迫下显著上调表达，是参与早期胁迫响应的关键基因。群体基因组分析揭示了这两个基因的单倍型在驯化大麦中呈现显著的“东-西”地理分化，表明其可能经历了不同的选择。该研究为深入理解大麦RS基因家族的功能及通过分子育种改良大麦抗逆性提供了重要的理论基础和基因资源。
材料与方法
本研究综合利用生物信息学和分子生物学方法，系统分析了大麦RS基因家族。首先，利用已知的拟南芥、水稻和玉米RS蛋白序列，对Morex V3版本的大麦参考基因组蛋白数据库进行BLASTP和HMMER搜索，鉴定出候选的HvRS基因。通过ExPASy ProtParam和Plant-mPLoc等在线工具预测了所鉴定蛋白的理论理化性质和亚细胞定位。利用MEME Suite、NCBI Batch CD-search和TBtools软件分析了HvRS蛋白的保守基序、保守结构域和基因结构。从大麦 (Hordeum vulgare)、小麦 (Triticum aestivum)、玉米 (Zea mays)、水稻 (Oryza sativa)、二穗短柄草 (Brachypodium distachyon) 等8种植物种选取了79个RS蛋白序列，通过MEGA7构建最大似然法系统发育树，揭示其进化关系。使用PlantCARE软件分析了每个HvRS基因起始密码子上游2000 bp启动子区域中的顺式作用元件。从公共数据库BarleyExpDB获取了Morex V3在16个不同组织/发育阶段的转录组数据 (FPKM值)，以分析HvRS基因的组织特异性表达模式。通过定量实时PCR (qRT-PCR) 实验，检测了耐逆大麦地方品种ZDM01411的幼苗在200 mmol/L NaCl (盐胁迫)、20% (w/v) PEG6000 (模拟干旱) 和100 μmol/L ABA处理下，根和地上部中HvRS基因在不同时间点 (1、6、12、24小时) 的表达变化。此外，基于76个大麦品种的泛基因组数据，对两个胁迫响应基因HvRS2和HvRS5进行了单倍型分析，以探究其遗传多样性和地理分布模式。
结果
3.1 大麦RS基因家族的鉴定
在大麦cv. Morex V3参考基因组中共鉴定出8个RS基因，命名为HvRS1至HvRS6。其中，HvRS4和HvRS6基因各有2个转录本，分别记为HvRS4.1/4.2和HvRS6.1/6.2。这8个基因分布在1H、2H、3H和7H四条染色体上。根据功能注释，HvRS1、HvRS2和HvRS3被注释为碱性α-半乳糖苷酶种子吸胀蛋白，HvRS4.1和HvRS4.2被注释为α-半乳糖苷酶，HvRS5、HvRS6.1和HvRS6.2被注释为棉子糖合成酶家族蛋白。HvRS蛋白的长度在322 (HvRS4.2) 到854 (HvRS6.2) 个氨基酸之间，预测分子量在35.3 kDa到90.5 kDa之间。除HvRS4.1外，所有蛋白均呈酸性。亚细胞定位预测显示，大部分HvRS蛋白定位于叶绿体和/或细胞质，而HvRS4.1特异定位于细胞壁。
3.2 RS蛋白家族的系统发育与共线性分析
对来自8种植物的79个RS蛋白进行的系统发育分析将其划分为五个明显的进化枝 (Clade I-V)。HvRS2、HvRS6.1和HvRS6.2属于最大的Clade I；HvRS1属于Clade II；HvRS3、HvRS5和HvRS4.1/4.2分别属于Clade III、IV和V。大麦、小麦和二穗短柄草的RS蛋白紧密聚类，显示出密切的进化关系。种间共线性分析发现，6个HvRS基因与小麦 (Triticum aestivum) 的直系同源基因存在18个共线基因对，与玉米、水稻等其他禾本科植物也存在多个共线基因对，表明RS基因在物种间进化保守。
3.3 保守基序、结构域和基因结构分析
保守基序分析显示，除HvRS4.1和HvRS4.2外，其他HvRS蛋白的基序类型和数量高度相似。HvRS1、HvRS2、HvRS6.1和HvRS6.2共享全部10个预测基序；HvRS3和HvRS5仅缺失基序9；而HvRS4.1和HvRS4.2仅包含6个基序。所有HvRS家族成员均含有保守的AmyAc超家族结构域。基因结构分析显示，HvRS基因的外显子数量差异很大，从2个 (HvRS5) 到15个 (HvRS4.1) 不等，暗示了功能分化。
3.4 HvRS基因启动子区域的顺式作用元件分析
在HvRS基因的启动子区域中，共鉴定出8至29个不等的顺式作用元件。其中，激素相关元件 (特别是对ABA、茉莉酸甲酯 (MeJA) 和生长素响应的元件) 最为丰富，占总数的42.7%；其次是光响应元件 (24.3%) 和胁迫响应元件 (19.7%)。与干旱诱导和盐胁迫相关的元件的存在，表明HvRS基因家族可能在非生物胁迫响应中扮演重要角色。
3.5 HvRS基因表达模式分析
组织特异性表达分析 (基于FPKM值) 显示，HvRS基因成员表达模式各异。HvRS4在几乎所有组织中均高表达。HvRS2在衰老叶片 (SEN)、发育籽粒 (CAR5) 和黄化幼苗 (ETI) 中高表达。HvRS3在表皮 (EPI)、衰老叶片 (SEN) 和节 (NOD) 中广泛高表达。HvRS1表现出明显的组织偏好性，在胚胎 (EMB) 和发育籽粒 (CAR5) 中高表达。HvRS5在正常条件下所有组织中表达量均极低。
qRT-PCR胁迫表达分析表明，HvRS2和HvRS5是关键的胁迫响应基因。在盐胁迫和ABA处理下，根中HvRS2的表达量显著上调，在盐处理24小时和ABA处理6小时时，分别达到对照的9.90倍和49.1倍。同样，根中HvRS5的表达在盐和ABA处理下也显著上调。在地上部，HvRS5的表达在盐和PEG处理6、12、24小时后被高度诱导，在盐胁迫6小时时表达量达到对照的40.0倍。这些结果表明HvRS2和HvRS5参与了幼苗早期的非生物胁迫响应。值得注意的是，根中HvRS4.1基因的表达在ABA处理6、12、24小时后被下调。
3.6 HvRS2和HvRS5的泛基因组单倍型分析
基于76个大麦基因型的泛基因组数据，对HvRS2和HvRS5进行了单倍型分析。HvRS2在驯化大麦 (包括品种和地方种) 中的编码序列高度保守，无氨基酸变异，但在野生大麦中具有多态性。共鉴定出19种单倍型，野生、地方种和品种中分别含有14、7和3种。驯化大麦的单倍型聚为两大组 (Group I和Group II)，显示出清晰的东-西地理分化：Group I主要为源自土耳其、叙利亚等地的西方大麦；Group II主要为源自中国、巴基斯坦等地的东方大麦。
HvRS5基因表现出更多的SNP和氨基酸变异，共鉴定出25种单倍型。驯化大麦中以Hap_1, Hap_2, Hap_3, Hap_4为主，占88.7%。这些单倍型同样可分为三组，并呈现出东-西方大麦的分化。推测HvRS2和HvRS5基因的不同单倍型可能在不同地理位置的驯化过程中经历了选择。
讨论与结论
棉子糖合成酶 (RS) 催化棉子糖家族寡糖 (Raffinose Family Oligosaccharides, RFOs) 生物合成的关键步骤，在植物胁迫耐受性、种子发育和寿命等方面具有重要作用。本研究首次对大麦RS基因家族进行了全基因组系统鉴定和综合分析。
系统发育和共线性分析揭示了HvRS基因家族的进化保守性，尤其与大麦近缘物种小麦和二穗短柄草关系密切。保守基序和基因结构的多样性暗示了家族成员的功能分化。启动子中丰富的激素和胁迫响应元件为其参与逆境适应提供了转录调控基础。表达分析明确了不同成员的功能倾向：HvRS4可能承担基础代谢功能；HvRS1特异参与种子发育；而HvRS2和HvRS5则被确定为早期胁迫响应的关键基因，在盐、旱和ABA处理下快速显著诱导。HvRS4.1在ABA处理下的下调表达提示其可能存在负调控作用，值得进一步研究。
单倍型分析为理解这两个关键基因的驯化历史提供了线索。HvRS2在驯化大麦中的高度序列保守暗示了强烈的驯化选择。HvRS5则保留了更高的多样性。两者在驯化大麦中均呈现显著的东-西地理分布的单倍型分化，这与大麦已知的传播和驯化路线相符，表明不同的单倍型可能适应了各自产区的环境压力。
综上所述，该研究系统描绘了大麦RS基因家族的图谱，鉴定出HvRS2和HvRS5为参与非生物胁迫响应的核心候选基因，并揭示了其单倍型的驯化选择印记。这些发现为后续通过基因编辑、过表达等功能验证研究，以及利用优势单倍型进行分子标记辅助育种以提升大麦抗逆性，奠定了坚实的理论基础。
