《Frontiers in Plant Science》：Gene family of Catharanthus roseus receptor-like kinase 1-like in Sorghum bicolor: identification, evolution, function, and stress response
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这篇综述系统性鉴定了高粱(Sorghum bicolor)中的CrRLK1L受体激酶基因家族，共发现28个成员。研究通过进化、结构和表达分析，揭示了该家族基因在根系发育及响应干旱、盐胁迫中的关键作用，为解析高粱抗逆分子机制及作物遗传改良提供了重要依据。
引言
Catharanthus roseus受体样激酶1同源(CrRLK1L)基因家族是植物受体样激酶(RLK)超家族的一个重要亚群，在调控植物生长、信号转导、繁殖和逆境适应中发挥着关键作用。CrRLK1L蛋白通常具有保守的结构，包含一个感知外界信号的胞外结构域、一个单次跨膜结构域和一个通过磷酸化传递信号的胞内激酶结构域。在拟南芥中，已有17个CrRLK1L成员被鉴定，其中FERONIA (FER)作为一个核心的多功能信号枢纽，整合多种配体和激素的输入，以调节生长、发育和胁迫响应。然而，尽管CrRLK1L基因家族已在拟南芥、水稻、玉米和番茄等模式植物和作物中得到系统表征，但在具有卓越耐旱和耐盐性的重要谷物作物高粱(S. bicolor)中，仍缺乏对该家族的全面基因组水平分析。
方法与材料
本研究从Phytozome v13数据库下载高粱基因组序列和注释文件。首先，结合隐马尔可夫模型(HMM)分析和双向BLAST方法，在高粱蛋白质数据库中鉴定潜在的CrRLK1L基因，并保留氨基酸序列长度大于400的成员。随后，通过Pfam和SMART数据库进行结构域分析，验证CrRLK1L保守结构域的存在。利用TBtools软件分析鉴定出的基因家族成员的理化性质，并基于基因组注释文件中的物理位置信息绘制其染色体位置图。为探究CrRLK1L基因家族的进化关系，本研究构建了包含高粱、水稻、玉米和拟南芥CrRLK1L成员全长氨基酸序列的系统发育树，使用MEGA 7软件中的邻接法(NJ)构建，并通过1000次重复的bootstrap分析评估拓扑结构的稳健性。基因结构和保守基序分析基于高粱基因组注释文件，利用MEME在线工具预测保守蛋白质基序。使用MCScanX软件进行基因组内共线性分析，以评估家族成员间的片段和串联重复事件，并利用TBtools软件计算重复基因对的非同义(Ka)和同义(Ks)替换率。启动子序列分析提取了每个基因起始密码子上游2000 bp的区域，并使用PlantCARE在线数据库预测顺式作用元件。组织表达模式分析利用高粱基因组和突变数据库(SGMD)的多组织转录组数据，以TPM值为标准。对于非生物胁迫处理，选用高粱自交系BTx623，在三叶期用200 mmol/L NaCl和20% PEG-6000分别模拟盐胁迫和干旱胁迫处理，在处理0小时和48小时后采集根样。通过RT-qPCR分析特定基因的表达，以ACTIN基因为内参，采用2-ΔΔCt方法计算基因表达水平。
结果
1. 高粱CrRLK1L基因家族成员的鉴定
在高粱基因组中共鉴定出28个CrRLK1L基因家族成员，并根据其在染色体上的物理位置命名为SbCrRLK1L1至SbCrRLK1L28。染色体定位分析显示这些基因在9条高粱染色体上分布不均匀，存在明显的成簇现象，例如SbCrRLK1L6/7/8紧密排列在2号染色体上，SbCrRLK1L23/24/25/26成簇分布在9号染色体上。对28个蛋白的理化性质分析表明，其氨基酸长度在812到1001之间，分子量在88.83 kDa到109.78 kDa之间，理论等电点(pI)值范围较广，多数蛋白(89.29%)为酸性pI(<7)。大多数蛋白(78.57%)的不稳定性指数低于40，表明结构较稳定。脂肪族指数显示其具有疏水特性，但亲水性总平均值(GRAVY)分析表明大多数蛋白为亲水性。
2. 系统发育分析
基于高粱、水稻和拟南芥CrRLK1L基因全长蛋白序列构建的系统发育树将这些成员分为五个不同的单系亚组(Group I至Group V)。分析发现，高粱和水稻的CrRLK1L基因始终聚集在同一主要分支内，而高粱和拟南芥的成员则分布在不同的分支上。值得注意的是，高粱基因SbCrRLK1L2与功能明确的FERONIA (AtFER)位于同一亚组，具有较近的亲缘关系。
3. 基因结构与保守基序
利用MEME工具在高粱CrRLK1L蛋白中鉴定出10个保守基序。基序1、2、3、4、9和10在绝大多数成员中一致存在，而基序6、7、8则主要存在于Group I和Group II的成员中，显示出亚组特异性。外显子-内含子结构分析揭示了显著的多样性：Group I和Group II的基因结构复杂，含有9到14个内含子；而Group III和Group IV的基因结构相对简单，仅含有1到3个内含子。
4. 重复事件与Ka/Ks分析
MCScanX分析表明，CrRLK1L基因家族的扩张由多种基因复制模式驱动，包括全基因组复制(WGD)、串联复制(TD)、近端复制(PD)、分散复制(DSD)和转座复制(TRD)。共鉴定出2个WGD基因对、1个TD基因对、3个PD基因对、10个TRD基因对和9个DSD基因对。有趣的是，SbCrRLK1L2表现出“一对多”的复制模式，与多个旁系同源基因存在共线关系。对所有重复基因对进行的Ka/Ks比值计算显示，其值均小于1，表明该基因家族在进化过程中主要经历了纯化选择。跨物种比较基因组学分析显示，高粱与水稻之间存在28个共线基因对，而与拟南芥之间仅有2对，这凸显了禾本科植物内部的进化保守性。
5. 启动子顺式作用元件分析
对启动子区(起始密码子上游2000 bp)的分析揭示了丰富的调控元件，主要分为三类：激素响应元件(如脱落酸响应元件ABRE、生长素响应元件AuxRR-core)、胁迫响应元件(如干旱诱导元件MBS、低温响应元件LTR)以及发育相关元件(如昼夜节律调控元件circadian、种子特异性表达元件RY-element)。值得注意的是，多个基因(如SbCrRLK1L1/3/7/8/5)的启动子同时含有ABRE和MBS元件，暗示它们可能参与ABA介导的干旱胁迫响应通路。此外，干旱响应的MBS元件广泛存在，表明该家族可能在高粱适应水分亏缺中扮演关键角色。
6. 组织特异性表达模式分析
基于多组织RNA-seq数据的表达谱分析显示，该家族成员在不同组织中表达差异显著，表现出明显的组织特异性。例如，SbCrRLK1L8/17/18/24/25/26在根中表达水平显著高于茎、叶、幼苗、花序和种子。相反，SbCrRLK1L10/21/27主要在中表达，而SbCrRLK1L19则在叶中表达最高。这些不同的表达模式暗示了CrRLK1L成员在高粱生长发育中的功能分化。
7. NaCl和PEG处理下SbCrRLK1L基因家族的表达模式
通过RT-qPCR分析特定成员在干旱和盐胁迫下的表达模式，结果显示不同基因具有特异的胁迫响应表达谱。在干旱胁迫下，SbCrRLK1L8/24/25的表达水平显著下调。而在盐胁迫下，SbCrRLK1L1和SbCrRLK1L17的表达显著上调，SbCrRLK1L8/24/25则持续低表达，表现出与干旱胁迫下类似的抑制模式。这些差异表达模式表明，SbCrRLK1L家族成员可能通过特化的通路介导胁迫适应。
讨论
1. 不同植物物种间CrRLK1L基因家族的比较分析
CrRLK1L基因家族成员的数量在不同植物物种间差异显著，反映了由基因复制事件和选择压力塑造的不同进化历史。高粱拥有28个成员，数量介于水稻(16个)和小麦(58个)之间，表明高粱经历了特定的基因组复制事件，导致了适度的家族扩张。基因结构分析显示，Group I和Group II成员结构复杂，而Group III和Group IV成员结构相对紧凑，这些结构差异可能反映了各亚家族为适应不同调控机制和功能需求而经历的进化分化。
2. 进化分析揭示CrRLK1L基因家族的进化模式
高粱与水稻CrRLK1L基因在进化树上的聚集，反映了二者在禾本科内的密切亲缘关系和潜在的功能保守性。该家族的扩张和多样化主要由基因复制事件驱动。片段复制事件提供了功能创新的遗传原材料，而串联复制则导致了染色体上基因簇的形成，这可能有利于在特定生物学过程中实现协调调控和协同作用。Ka/Ks比值分析表明，该家族经历了强烈的纯化选择，这有助于在漫长进化过程中维持基因的核心功能完整性。
3. 表达模式与植物生长和胁迫响应的关联
SbCrRLK1L1和SbCrRLK1L17在盐胁迫下的显著上调，暗示它们可能参与维持离子稳态或调节盐信号通路。这一观察结果与拟南芥中FERONIA通过感知RALF肽并与细胞壁相关的LRX蛋白互作以调节盐胁迫下离子平衡和细胞完整性的机制相呼应。另一方面，SbCrRLK1L8/24/25在两种胁迫下的一致下调，可能反映了一种策略性的资源重分配机制。这些基因可能作为生长相关过程(如细胞伸长或光合作用)的抑制因子，使植物能够节省能量并将资源重新分配到胁迫防御机制中。启动子分析发现这些下调基因的启动子区域含有干旱响应元件，进一步支持了它们在干旱适应中的潜在功能。激素信号通路，特别是涉及ABA、JA和生长素的通路，可能在该调控网络中起到关键的整合作用。
4. 本研究的创新贡献与局限性
本研究首次对高粱CrRLK1L基因家族进行了全面的生物信息学分析和表达谱分析。通过整合多种生物信息学工具和数据库，系统鉴定了高粱CrRLK1L基因，分析了其理化性质、染色体定位、系统发育关系、基因结构、保守基序、复制事件、启动子元件及表达模式。在干旱和盐胁迫下的表达分析为解析高粱抗逆分子机制提供了重要线索，突出了可用于耐胁迫作物育种的有价值遗传资源。然而，目前基因功能主要基于生物信息学和表达分析推断，缺乏实验验证。未来工作可包括克隆感兴趣基因并在转基因体系中进行功能研究，以阐明高粱CrRLK1L成员的确切作用和机制。家族成员间的相互作用及其与其他信号通路的串扰也有待探索，是另一个重要的研究方向。
结论
总而言之，在高粱基因组中鉴定出28个SbCrRLK1L基因。系统发育树显示CrRLK1L分为四个Group。同一Group的SbCrRLK1L具有相似的基因结构和保守基序。复制事件分析表明，SbCrRLK1L基因家族的扩张主要由多种基因复制模式驱动，并伴随着强烈的纯化选择。组织表达模式分析显示SbCrRLK1L8/17/18/24/25/26可能在根发育中发挥重要作用。此外，研究发现SbCrRLK1L可能在高粱响应非生物胁迫、生物胁迫和营养缺陷中扮演关键角色。在PEG6000和NaCl处理下，SbCrRLK1L1表现出相反的表达模式，而SbCrRLK1L8/24/25表现出相似的下调模式。本研究为进一步研究SbCrRLK1L基因在高粱乃至其他植物中的功能奠定了基础。
