体外血脑屏障三重共培养模型与计算模拟整合策略预测环境污染物脑部暴露风险

本文综述了一种创新的人体体外血脑屏障（BBB）直接接触三重共培养模型。该模型整合了人源原代星形胶质细胞、周细胞和脑微血管内皮细胞（HBEC-5i），可更真实地模拟体内BBB的屏障功能和细胞间信号传导。通过测量超过50种化合物（包括环境污染物和CNS药物）的双向表观渗透性（Papp）和外排比，并将其与美国环保署（EPA）开发的高通量毒代动力学（HTTK）模型结合，本研究旨在构建一个能够更准确地预测污染物在慢性暴露下脑部蓄积风险的计算框架。该整合策略为评估中枢神经系统（CNS）药物递送和环境污染物神经毒性风险提供了更具生理相关性的新方法。

　　

引言

神经毒性是许多环境污染物和治疗药物的关键安全隐患，对公共健康和监管机构构成了重大挑战。目前，体外神经毒性筛选通常采用超过生理相关水平的浓度直接将外源性物质暴露于培养的神经元，这主要归咎于研究中缺少功能性血脑屏障（BBB）的模拟。BBB由脑微血管内皮细胞（BMECs）通过紧密连接相互连接，并由星形胶质细胞和周细胞支持，其功能是限制物质从血流进入脑实质。现有筛选方法因缺少BBB模拟，可能导致过高估计化合物的神经毒性效力或误判其安全边际，这已成为阻碍体外到体内外推（IVIVE）用于神经毒性风险评估的一个公认缺陷。为弥补这一关键不足，本研究旨在应用并评估一个生理相关的体外直接接触三重共培养BBB模型。

材料与方法

研究中使用了人原代脑星形胶质细胞、血管周细胞以及永生化的人脑微血管内皮细胞系（HBEC-5i）。BBB三重共培养模型建立在Transwell?小室（直径12 mm，孔径0.4 μm）上。小室预先用多聚赖氨酸（PLL）包被。首先将原代星形胶质细胞接种于小室顶侧，培养48小时形成单层。随后，将原代周细胞直接接种在星形胶质细胞层上，再培养48小时。接着，在星形胶质细胞-周细胞双层上铺设一层稀释的基质胶，以模拟神经血管单元的细胞外基质环境。最后，将HBEC-5i细胞接种于其上，完成三重共培养的组装。共培养物在标准条件下继续培养9天，以使紧密连接、屏障完整性和功能性转运蛋白表达成熟，之后进行渗透性评估。

在培养第9天，对模型进行双向渗透性测定。测试了包括中枢神经系统药物、环境毒物、工业化学品和新兴监管关注化合物在内的超过50种化合物，浓度为50 μM或100 μM。对于顶侧到底侧（A→B，模拟血液到脑）的转运，将化合物加入顶侧（供体）室，并在不同时间点（30, 60, 90, 120, 150, 180分钟）从底侧（受体）室取样。对于底侧到顶侧（B→A，模拟脑到血液）的转运，则采用相反配置。每个化合物测试三个重复。所有样品通过高效液相色谱（HPLC）分析。表观渗透性（P_app，单位 cm/s）通过标准公式计算，其中涉及化合物跨细胞层的量随时间的变化（dM/dt）、供体室初始浓度（C₀）、过滤器支持表面积（SA）以及从分钟到秒的转换因子。

结果

所建立的三重共培养模型与内皮细胞单独培养相比，表现出增强的紧密连接组织（如occludin, claudin-5, ZO-1的表达）和增加的外排转运蛋白（如P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药相关蛋白2（MRP2））表达，表明其具有改进的屏障表型。研究成功测量了多种化合物的双向P_app值，并计算了外排比（P_app^BA/P_app^AB）。结果显示了化合物间广泛的渗透性谱，P_app^AB值范围从尼古丁的0.08 × 10^-6cm/s到丙戊酸和戊唑醇的大于500 × 10^-6cm/s。外排比也呈现多样性，例如甲氟喹的外排比高达7.81，而贝利司他的外排比低至0.004。根据P_app值，化合物被分类为慢速、中等、快速和极快速渗透。

在计算模拟方面，研究将测量的体外BBB渗透性数据与从美国环保署（EPA）的高通量毒代动力学（HTTK）R包中获取的化合物特异性参数（如血液中未结合分数（F_ub））相结合。该集成方法用于进行两种预测。首先，对于急性暴露，将化合物视为从血液到脑的单向流入过程，估算脑摄取的半衰期（t_1/2）。计算基于一级速率常数（k），该常数是F_ub、假设的成人脑毛细血管总表面积（A_BBB，20 m²）和测量的顶侧到底侧P_app^AB的乘积。其次，对于慢性暴露，模型预测了稳态下的脑组织浓度（C_{ss, brain}）。这涉及考虑双向跨BBB转运（由P_app^{AB和P_appBA描述）以及来自HTTK的预测稳态血清浓度（C_{ss, serum}）。该方法能够估计在长期、恒定暴露条件下，有毒物在脑实质中的潜在蓄积。}

讨论

将体外BBB渗透性测量与毒代动力学建模相结合，为预测中枢神经系统（CNS）暴露和神经毒性风险提供了一种生理相关的方法。本研究开发的三重共培养模型在结构和功能上更接近地概括了体内神经血管单元，与单层内皮细胞培养相比，产生了更具限制性的屏障。通过使用这个模型获得的大量化合物特异性BBB转运数据，显著增强了计算模拟的可靠性。通过将实验得出的渗透性系数作为关键输入参数整合到HTTK框架中，该研究扩展了现有模型（原模型不包含脑室）预测脑部暴露的能力。这种整合框架实现了从体外神经毒性测定浓度到体内等效脑剂量的更真实转换，提高了危害预测和风险评估的置信度。研究者假设，未来的研究者可以简单地通过进行体外BBB渗透性研究，来确定潜在脑蓄积和神经毒性的相对风险。这项工作与减少研究中使用动物的监管倡议（例如《FDA现代化法案3.0》）相一致，强调了在基于细胞的筛选模型中建立生理相关性的重要性。