《Marine Biotechnology》：Noninvasive Epidermal Mucus RNA-Seq Analysis for Developing Methods to Evaluate Environmental Stress in the Japanese Eel (Anguilla japonica)
编辑推荐：
随着气候变化加剧，水温波动和强降雨频发对河川环境造成显著影响，可能对野生日本鳗鲡的生理状态构成环境胁迫。研究人员开展了一项主题为“利用日本鳗鲡表皮粘液进行非侵入性RNA-Seq分析以评估环境胁迫”的研究。研究发现，在悬浮固体胁迫下，表皮粘液中与细胞免疫和炎症通路相关的基因表达上调；在低温胁迫下，脂质代谢相关基因（如scd、prom2、tmem64）表达增加；在高温胁迫下，热激反应基因表达增强。该研究成功从非侵入性样本中识别出对应每种胁迫的特异性表达基因，为未来开发评估野生日本鳗鲡生理状态的非侵入性方法提供了有力支持。
在日本列岛的河流中，洄游着一种充满神秘色彩的经济鱼类——日本鳗鲡。它们的一生是跨越海洋与淡水的史诗，对东亚地区的水产养殖和内陆渔业至关重要。然而，近几十年来，日本鳗鲡的野生种群数量急剧下降，已被列入日本环境省和国际自然保护联盟的濒危物种红色名录。导致其衰退的原因复杂，包括过度捕捞、栖息地退化，以及日益受到关注的气候变化影响。气候变化引发的极端降雨和水温波动，正深刻改变着河流环境，对包括鳗鲡在内的淡水鱼类构成持续的生理胁迫。为了有效保护这一濒危物种，及时、准确地评估其在自然环境中的“健康状态”（即生理压力水平）至关重要。然而，传统的评估方法通常需要采集组织或器官样本，这意味着必须牺牲个体，这对于保护野生种群而言是不可取的。那么，是否存在一种不伤害鳗鱼本身，又能精准窥探其生理压力“秘密”的方法呢？答案或许就隐藏在它们滑腻的身体表面。
近期，一项发表在《Marine Biotechnology》上的研究给出了一个充满前景的方案。该研究创新性地将目光投向了日本鳗鲡体表那一层薄薄的“保护外衣”——表皮粘液。表皮粘液是鱼类与外界环境之间的第一道物理和化学屏障，在维持内稳态和抵御病原体方面扮演着关键角色。更重要的是，采集粘液样本对鱼体几乎没有损伤，是一种理想的非侵入性采样介质。研究人员大胆设想：能否通过分析这层粘液中的信使RNA（RNA），来解读鳗鱼在面临不同环境压力时的生理“密电码”？为此，他们开展了一系列严谨的实验，旨在探究利用表皮粘液进行RNA测序（RNA-Seq），评估日本鳗鲡应对环境胁迫的可行性。
研究者们运用了多个关键技术方法来验证他们的设想。首先，他们从商业供应商处获取了不同规格的日本鳗鲡个体，在实验室条件下模拟了两种与气候变化相关的环境压力：一是通过添加高岭土来模拟强降雨导致的沉积物径流，即悬浮固体胁迫；二是设置不同的水温（10℃、20℃、30℃）来模拟温度变化。研究人员分别从经历不同胁迫处理和正常条件下的鳗鱼身上，无创地采集了表皮粘液样本，并同时解剖采集了皮肤、肌肉、尾鳍、鳃、肝脏等组织作为对照。随后，他们使用商业试剂盒提取了所有样本的总RNA。核心的分析技术是RNA-Seq，即利用下一代测序平台对样本中的RNA进行高通量测序。获得的测序数据经过质量过滤后，比对到日本鳗鲡的参考基因组上，计算出每个基因的表达量。通过主成分分析、差异表达基因筛选、组织特异性指数τ计算、富集分析（如Metascape）以及实时定量聚合酶链式反应验证等一系列生物信息学和分子生物学手段，系统比较了不同组织、不同胁迫条件下的基因表达谱变化。
研究结果
RNA-Seq分析正常条件下的表皮粘液
在正常状态下，对表皮粘液、皮肤、肌肉、尾鳍和鳃进行的RNA-Seq分析显示，表皮粘液的基因表达模式与皮肤、鳍、鳃等其他直接接触外界环境的组织明显不同，形成了一个独立的簇。分析鉴定出102个表皮粘液特异性表达的基因。对这些基因的富集分析显示，“核糖体”和“脂肪细胞因子信号通路”是显著富集的通路。在表皮粘液中表达量最高的10个基因里，有8个与生物防御功能相关，包括涉及炎症反应、抗菌肽以及穿孔素超家族的基因。这表明，在基础状态下，日本鳗鲡的表皮粘液就可能作为抵御病原微生物入侵的重要前线屏障。
胁迫样本RNA-Seq分析概览
在悬浮固体胁迫实验中，表皮粘液中检测到的差异表达基因数量最多，显著高于肝脏、鳃和皮肤。在温度胁迫实验中，低温组在所有分析组织中诱发的差异表达基因总数最多，远高于高温组，表明日本鳗鲡对低温胁迫更为敏感。维恩图分析进一步显示，在不同胁迫下，表皮粘液中上调的基因与其他组织（皮肤、鳃、肝脏）的重叠度很低，说明表皮粘液对环境胁迫产生了独特的生理响应。
SS胁迫下表皮粘液的RNA-Seq分析
在悬浮固体胁迫下，表皮粘液中上调基因的富集分析结果显示，大量与生物防御过程相关的通路被显著激活，包括“防御反应”、“对细菌的反应”、“吞噬体”、“单核细胞迁移”、“中性粒细胞脱颗粒”和“PPAR信号通路”等，主要涉及细胞免疫和炎症反应。上调最显著的10个基因可分为两类：一类是微管蛋白基因，另一类是免疫相关基因。通过RT-qPCR验证，其中8个基因的表达在胁迫组中均被确认上调。这些结果说明，高岭土被表皮粘液识别为外来物质，激活了鳗鱼的生物防御机制，也可能因机械摩擦直接诱发了免疫反应。
温度胁迫下表皮粘液的RNA-Seq分析
- •
低温胁迫：富集分析表明，在所有分析组织中，包括表皮粘液，与免疫反应、核糖体生物合成以及蛋白质折叠相关的通路均被激活。在表皮粘液中上调最显著的10个基因包括与脂质代谢相关的scd、prom2、tmem64，以及与免疫、胶原分泌、RNA剪接调控等相关的基因。RT-qPCR验证了scd、prom2、rbpms和muc2的上调。其中，scd是冷胁迫下的经典响应基因，参与增加细胞膜流动性以增强耐寒性；rbpms和muc2的上调则可能共同促进了低温下粘液分泌的增加。
- •
高温胁迫：在所有分析组织中，与热激反应相关的通路，如“对温度刺激的反应”、“蛋白质重折叠”和“内质网中的蛋白质加工”均被富集。经典的热激蛋白基因hsp90在表皮粘液中的表达经RNA-Seq和RT-qPCR证实显著上调。表皮粘液中上调最显著的10个基因包括与氧化应激相关的txnip和ctbp2，与昼夜节律相关的per3，以及角蛋白基因krt8和krt13。RT-qPCR验证了krt8、krt13和txnipa的上调，并发现这两个角蛋白基因在低温下表达有下降趋势，提示它们可能作为热胁迫的潜在指示物。角蛋白的上调可能是一种保护性反应，旨在减轻高温对表皮细胞的损伤。
研究结论与意义
本研究系统评估了利用日本鳗鲡表皮粘液进行非侵入性RNA-Seq分析，以评估其应对环境胁迫（浊度和温度）生理状态的潜力。研究得出以下核心结论：首先，在正常条件下，日本鳗鲡表皮粘液具有独特的基因表达谱，富含与先天免疫防御相关的基因，证实了其作为一线生物屏障的功能。其次，面对不同的环境胁迫，表皮粘液能产生特异且敏感的转录组响应。悬浮固体胁迫主要激活了与细胞免疫和炎症相关的通路；低温胁迫引发了广泛的生理调整，包括脂质代谢适应、免疫激活和可能的粘液分泌增加；高温胁迫则触发了典型的热激反应、氧化应激响应以及可能与细胞保护相关的角蛋白表达上调。
这项研究的重要意义在于，它成功地将非侵入性采样（表皮粘液采集）与高灵敏度的转录组学技术（RNA-Seq）相结合，为评估野生濒危鱼类日本鳗鲡的生理健康状况开辟了一条全新的、动物友好的技术路径。通过识别出一系列与特定环境胁迫相对应的基因表达标志物，该研究为未来开发基于现场粘液采样和快速分子检测的监测工具奠定了坚实的科学基础。这种方法未来若应用于野外，将使研究人员和保育工作者能够在不断加伤害的情况下，实时了解野生鳗鲡种群所承受的环境压力水平，从而为制定更精准、更有效的栖息地保护和管理策略提供关键数据支持，对于扭转日本鳗鲡的种群衰退趋势具有重要的应用价值。
