《Frontiers in Immunology》：Concentration-dependent effects of tobacco smoke on airway inflammation and remodeling in asthmatic models
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本文综述了烟草烟雾（CS）对嗜酸粒细胞性（EA）、中性粒细胞性（NA）和混合粒细胞性（MGA）哮喘模型的影响。研究表明，CS暴露以浓度依赖方式（100 vs 800 mg/m3）恶化临床症状，上调促炎因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6、MCP-1、IL-12）并下调抗炎因子IL-10，加剧肺组织病理损伤、杯状细胞增生（GCM）及肺纤维化，为临床精准干预提供了实验依据。
引言：哮喘的异质性与环境挑战
支气管哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病，全球患者超过3亿。典型的2型（Th2-high）炎症通路是大多数轻中度过敏性哮喘的主要免疫病理机制，其特征是嗜酸粒细胞浸润、IgE升高以及IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子过度产生。然而，约20%–40%的重症或难治性哮喘患者表现出非2型或混合炎症表型，气道以中性粒细胞浸润或嗜酸粒细胞与中性粒细胞共同浸润为主，并伴有Th1/Th17相关细胞因子（如IFN-γ、IL-12、IL-17）显著升高。这些不同的炎症内型在糖皮质激素反应性、急性加重频率和长期预后方面差异显著。
除了内源性免疫失调，环境暴露在哮喘的发生和加重中起着关键作用。烟草烟雾是最明确的、可改变的风险因素之一。主动和被动吸烟都会显著增加哮喘发病率、诱发急性加重、降低皮质类固醇敏感性并加速肺功能不可逆下降。烟草烟雾含有超过7000种化合物，可直接损害气道上皮屏障，激活NF-κB和MAPK等促炎信号通路，诱导大量促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1）释放，同时抑制抗炎细胞因子IL-10，导致气道炎症持续放大。更重要的是，烟草烟雾可通过上调T-bet和RORγt等转录因子，促进炎症表型从Th2主导向Th1/Th17主导转变，从而加剧非嗜酸粒细胞性炎症。动物研究进一步证明，烟草烟雾暴露显著增强杯状细胞化生、粘液高分泌、上皮下胶原沉积和气道上皮平滑肌增生，最终驱动不可逆的气道重塑。
迄今为止，大多数研究烟草烟雾对哮喘影响的研究仅依赖于经典的卵清蛋白（OVA）致敏/激发嗜酸粒细胞性哮喘模型，而在中性粒细胞性和混合粒细胞性重症哮喘模型中对烟草烟雾暴露的系统比较分析仍然缺乏。因此，本研究在常规嗜酸粒细胞性哮喘（EA）模型基础上，分别通过鼻内给予高剂量（10 μg）和低剂量（0.1 μg）脂多糖（LPS），建立了中性粒细胞性哮喘（NA）模型和混合粒细胞性哮喘（MGA）模型。随后将小鼠暴露于两种浓度（100 mg/m3 和 800 mg/m3）的烟草烟雾环境中，以模拟轻度和重度烟草暴露环境。通过多维度综合评估临床表现、炎症细胞因子谱、气道炎性细胞浸润、杯状细胞化生和肺纤维化，旨在阐明烟草烟雾暴露对不同炎症表型哮喘模型气道炎症和重塑的影响及其潜在的浓度依赖性特征，从而为临床重症哮喘的精准干预策略提供实验证据。
材料与方法
实验动物与模型建立
60只4周龄、体重15 ± 2 g的SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为10组（n=6/组）：空白对照组、嗜酸粒细胞性哮喘（EA）模型组、EA+100 mg/m3烟草暴露组、EA+800 mg/m3烟草暴露组、中性粒细胞性哮喘（NA）模型组、NA+100 mg/m3烟草暴露组、NA+800 mg/m3烟草暴露组、混合粒细胞性哮喘（MGA）模型组、MGA+100 mg/m3烟草暴露组、MGA+800 mg/m3烟草暴露组。
EA模型通过腹腔注射OVA溶液致敏，并通过雾化吸入6% OVA激发建立。NA模型在EA模型基础上，于激发期的第2、4、6天，每次OVA雾化激发前30分钟鼻内给予10 μg LPS。MGA模型则在激发期相同时间点鼻内给予0.1 μg LPS。
烟草烟雾暴露干预
烟草暴露于建模开始后（从第21天起，在OVA雾化后30分钟）进行。100 mg/m3环境：使用1支去除过滤嘴的商业香烟产生的烟雾，使总颗粒物浓度维持在100 mg/m3，每次暴露30分钟，每日两次，每周5天，连续4周。800 mg/m3环境：使用5支去除过滤嘴的香烟，使浓度达到800 mg/m3，暴露方案相同。
观察指标与检测
记录小鼠一般状况和每周体重。末次激发24小时后处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织。采用ELISA法检测BALF中促炎因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12、MCP-1）和抗炎因子IL-10水平。通过瑞氏-吉姆萨染色对BALF沉渣涂片进行炎症细胞分类计数。肺组织经固定、脱水、包埋、切片后，分别进行苏木精-伊红（HE）染色观察组织病理变化，过碘酸-雪夫（PAS）染色观察支气管杯状细胞增生和粘液分泌，马松三色（Masson）染色评估肺纤维化程度。使用Image-Pro Plus软件分析胶原面积百分比。数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）和Tukey HSD事后检验进行统计分析，P < 0.05为有统计学差异。
结果
烟草浓度对不同表型哮喘小鼠一般状况的影响
与空白对照组相比，EA、NA、MGA模型组小鼠均出现呼吸急促、流涕、被毛无光泽、咳嗽频率显著增加等症状。100 mg/m3和800 mg/m3烟草暴露组小鼠的咳嗽频率较其对应的非暴露哮喘模型组明显增加，且800 mg/m3组增加更为显著。体重监测显示，所有哮喘模型组及其烟草暴露组的平均体重增长率均显著低于空白对照组（P < 0.001），表明哮喘症状与小鼠全身健康状况密切相关。
烟草浓度对不同表型哮喘小鼠炎症细胞因子表达的影响
与空白对照组相比，EA、NA、MGA模型组小鼠BALF中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、MCP-1、IL-12水平显著升高，而抗炎因子IL-10水平显著降低。与各自的模型组相比，100 mg/m3和800 mg/m3烟草暴露均能显著增加促炎因子水平并降低IL-10水平，且800 mg/m3浓度下的效应通常更为明显。数据显示，烟草暴露以浓度依赖的方式加剧了不同炎症哮喘模型的气道炎症，其特征是促炎细胞因子表达增加和抗炎细胞因子表达减少。值得注意的是，IFN-γ和IL-12（Th1相关细胞因子）的显著升高提示烟草烟雾可能使Th2主导的过敏性哮喘向混合Th1/Th2表型转变。
烟草浓度对不同表型哮喘小鼠炎症细胞计数的影响
瑞氏-吉姆萨染色结果显示，与空白对照组相比，EA、NA、MGA模型组小鼠BALF中总细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞计数均有所增加，但差异无统计学意义。100 mg/m3烟草暴露组与其对应模型组相比，炎症细胞计数也呈非显著性增加。然而，在800 mg/m3烟草暴露组中，与NA模型组相比，其总细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞计数均显著更高；与MGA模型组相比，其总细胞和嗜酸粒细胞计数也显著更高。这些结果表明烟草暴露促进了炎症细胞浸润，且800 mg/m3浓度下的促炎效应更为明显。
烟草浓度对不同表型哮喘小鼠肺组织病理学的影响
HE染色结果显示，空白对照组支气管上皮形态正常，无炎性细胞浸润或出血。EA、NA、MGA模型组表现为轻度局灶性（多数）至多灶性（少数）炎性细胞浸润，主要分布在细支气管、终末细支气管和血管周围区域，以中性粒细胞、嗜酸粒细胞或单个核细胞为主。100 mg/m3烟草暴露组显示轻度局灶性至多灶性炎性浸润，偶见出血。800 mg/m3烟草暴露组则显示轻度至中度多灶性（多数）至弥漫性（少数）急性或亚急性炎性浸润和出血，炎性细胞分布于肺泡腔和支气管腔内。与空白对照组相比，所有模型组的组织病理学损伤更严重。与各自的模型组相比，两个烟草暴露组（尤其是800 mg/m3组）表现出更严重的肺组织病理损伤，表明烟草暴露以浓度依赖的方式加剧了不同炎症哮喘模型的肺组织病理损伤。
PAS染色用于评估杯状细胞增生。空白对照组未见杯状细胞增生。与模型组相比，100 mg/m3烟草组杯状细胞百分比增加不显著，而800 mg/m3烟草组则显著增加。这些结果提示烟草暴露促进了杯状细胞增生，可能通过增加粘液分泌而加重哮喘。
Masson三色染色用于评估肺纤维化程度。与空白对照组相比，模型组纤维化程度增加不显著。100 mg/m3烟草组纤维化程度增加不显著，而800 mg/m3组则出现明显的纤维化，胶原表达百分比显著增高。这些结果表明烟草暴露通过促进纤维化过程，加重了不同炎症哮喘模型的哮喘反应。
讨论
本研究证明，烟草烟雾在EA、NA和MGA哮喘模型中均加剧了气道炎症和结构重塑，且在更高的颗粒物浓度下效应更强。这些发现与先前的机制研究和体内数据一致，表明香烟烟雾通过氧化和免疫途径放大气道细胞因子产生、粘液化生和细胞外基质重塑。
首先，我们观察到烟雾暴露后BALF中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IFN-γ和I
