《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Biofertilizer development through fermentation of dark septate endophytes: Valorization of lignocellulosic residues for enhanced growth and drought resistance of
Isatis indigotica
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DSE和曲霉属真菌可通过固态发酵降解甘草残余物和玉米秸秆，其发酵产物促进大豆苗生长并增强抗旱性，混合应用效果更优。
李婉云|杨瑞聪|王刚|陈彩霞|曹一鸣|朱正宇|杨晓彤|何超|李先恩
中国科学院药用植物研究所与北京协和医学院联合研究院，北京，100193，中国
摘要
暗隔内生菌（DSE）和木霉属菌株都能增强植物的生产力和适应性。研究DSE的木质纤维素降解特性有助于揭示其生态功能。在本研究中，通过固态发酵实验探讨了Paraboeremia selaginellae和Paraphoma chlamydocopiosa在木质纤维素降解中的作用。随后，通过盆栽实验研究了P. selaginellae、P. chlamydocopiosa和Trichoderma afroharzianum的发酵产物对Isatis indigotica生长发育和抗旱性的影响。结果表明，这两种DSE菌株对培养环境和养分来源具有广泛的适应性。结合单因素优化和响应面方法优化的方法有效提高了DSE在降解甘草残渣和玉米秸秆混合木质纤维素残渣中的纤维素活性。在最佳发酵条件下，P. selaginellae和P. chlamydocopiosa发酵残渣在连续发酵30天后的纤维素降解率分别达到27.63%和31.51%。真菌发酵产物的应用通过改善土壤结构和肥力促进了I. indigotica的根系发育和生物量积累。DSE发酵残渣通过激活抗氧化和渗透调节系统增强了I. indigotica的抗旱性。多种真菌产物的混合使用更能有效应对环境胁迫。在水分充足的条件下，两种DSE发酵残渣的混合应用效果最佳；而在干旱胁迫下，三种真菌发酵残渣的联合应用表现更优。这些研究结果将推动共生真菌在药用植物栽培和生物肥料开发中的应用。
引言
微生物肥料来源于富含特定功能性微生物的分解有机残渣，是传统农用化学品的可持续替代品[28]。通过促进植物生长、提高作物产量和质量以及调节土壤环境，微生物肥料可以减少农业生产对化学投入的依赖[11]，[78]。农业和工业木质纤维素残渣（如玉米秸秆和甘草残渣）富含植物可利用的物质，包括纤维、黄酮类、多糖、脂类、蛋白质和多种无机养分，是生产生物肥料的理想低成本原料[71]，[74]。固态发酵（SSF）是生物肥料生产的关键生物转化技术，能够有针对性地降解木质纤维素残渣，同时促进有益微生物的增殖，从而释放促进植物生长的因子[28]。然而，目前用于木质纤维素SSF制备微生物肥料的常用菌株谱系较窄，主要是芽孢杆菌属和木霉属，而其他有益微生物（特别是内生真菌）的潜力尚未得到充分探索，尽管已有研究表明它们具有将木质纤维素残渣发酵为生物肥料的潜力（Marques等人，2018年）。
暗隔内生菌（DSE）是一类分类学上多样的子囊菌，它们在植物根部形成暗隔菌丝和微菌核，在多种生态系统的600多种植物根系中广泛定殖[52]，[58]。DSE在盐碱、重金属污染和干旱等非生物胁迫环境中尤为常见，这表明它们在增强宿主植物生长和耐逆性方面具有重要作用[24]，[46]，[63]，[64]。DSE对植物的有益影响还包括改善养分吸收[72]。DSE通过增加土壤中养分的有效性来积极影响植物对养分的吸收，这是DSE与植物相互作用的主要间接养分交换机制[58]。最近的基因组和功能研究证实，DSE具有降解土壤中复杂大分子化合物的能力[58]。我们的初步研究证实了DSE在木质纤维素SSF中的应用价值，选定的DSE菌株（Paraphoma chlamydocopiosa和Paraboeremia selaginellae）既具有降解木质纤维素的能力，又具有促进植物生长的潜力[34]。同时，这两种菌株还显示出与T. viride共发酵的潜力[35]。DSE对宿主的促进多样性、木质纤维素降解能力以及与其他有益微生物的非拮抗性使其成为未来农业微生物技术研究的新热点。以DSE为核心菌株开发高价值生物肥料对于那些现有微生物技术无法解决产量调控问题的药用植物具有重要意义。
Isatis indigotica是中国广泛栽培的药用草本植物，其根和叶都具有药用价值[77]。尽管I. indigotica的栽培技术已经成熟，但土壤退化已成为制约其生长和质量的主要因素[76]。目前I. indigotica的生产仍严重依赖化学肥料，且针对I. indigotica设计的商业微生物接种剂十分有限。此外，不同生产区域的气候差异显著，主要种植区如甘肃、内蒙古和新疆位于干旱或半干旱地区，水资源短缺严重限制了I. indigotica产业的发展[84]。鉴于DSE在促进植物生长和增强抗旱性方面的能力，基于DSE开发的微生物肥料有望在干旱和非干旱的主要I. indigotica生产区发挥广泛的应用潜力[34]，[36]。
本研究利用SSF实验探讨了P. selaginellae和P. chlamydocopiosa在木质纤维素降解中的作用。随后进行了盆栽接种实验，以评估这两种DSE菌株和Trichoderma afroharzianum的发酵产物对I. indigotica生长和抗旱性的影响。提出以下假设：(1)P. chlamydocopiosa和P. selaginellae的SSF过程可以有效降解甘草残渣和玉米秸秆的混合木质纤维素残渣；(2) DSE发酵产物的应用可通过多种途径增强I. indigotica的生长发育和抗旱性，包括改善土壤结构和肥力、改变根系结构以及激活I. indigotica的抗氧化和渗透调节系统。这些数据将凸显DSE在药用植物栽培中的重要性，为I. indigotica的高质量栽培和定制微生物肥料的发展奠定理论基础。
部分内容摘要
真菌材料及其在不同培养条件下的平均生长率响应
两种DSE菌株Paraboeremia selaginellae（MT723859）和Paraphoma chlamydocopiosa（MT723851）分别从Astragalus membranaceus和Atractylodes macrocephala的根部分离获得[18]，作为SSF的真菌材料。根据Li等人的方法[37]，从Stemona japonica的根际土壤中分离出的Trichoderma afroharzianum（MT 734073）用于制备T. afroharzianum发酵残渣。
DSE对不同培养pH值的响应
P. selaginellae和P. chlamydocopiosa的最佳生长pH值为弱酸性环境（pH 4-6）。极端酸性环境（pH 3）和中性至碱性环境（pH 7-10）抑制了这两种DSE菌株的菌丝生长。与极端酸性环境相比，P. selaginellae和P. chlamydocopiosa对极端碱性环境（pH 9-10）的适应性更强。P. selaginellae对pH变化的敏感性高于P. chlamydocopiosa。
不同培养条件对DSE生长的影响
值、温度、碳源和氮源都是影响微生物生长和繁殖的关键控制因素，因为它们直接影响细胞内酶活性、代谢途径和细胞膜稳定性[37]，[42]，[9]。这两种测试的DSE菌株均来自相同的栖息地，其分离环境的一致性使得它们具有相对相似的生物学特性。结论
在本研究中，P. selaginellae和P. chlamydocopiosa在23-33℃的弱酸性环境中生长最佳，并表现出对碳源和氮源的广泛适应性以及耐寡营养环境和干旱胁迫的能力，这表明它们适合用于木质纤维素SSF过程。通过单因素优化和响应面方法优化，找到了P. selaginellae和P. chlamydocopiosa发酵玉米残渣的最佳条件。
资助
本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2022YFC3501501）的支持。
CRediT作者贡献声明
王刚：资源提供。
杨瑞聪：指导、资源协调。
李婉云：撰写——初稿、方法设计、数据管理。
杨晓彤：数据管理。
朱正宇：数据管理。
曹一鸣：资源协调。
陈彩霞：指导。
李先恩：撰写——审稿与编辑、指导、资金筹集、概念构思。
何超：撰写——审稿与编辑、指导、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢Menghui Wang、Wenjing Chen、Yali Xie、Wanyi Zhang和Duo Wang在实验中的技术协助。
利益冲突声明
所有作者声明没有利益冲突。
