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本研究开发了一个整合了光遗传刺激、钙成像、自动化采集与单细胞及网络分析的开放源码、可扩展的平台。它能够在多个时间点上对数百个人类干细胞衍生神经元的自发和诱发活动进行稳健量化，支持在细胞和网络水平的功能表型分析，并成功应用于CDKL5缺陷症、SSADH缺陷症和结节性硬化症等疾病模型，为人类神经元模型的高通量筛选和可扩展功能表型分析提供了通用框架。
开源钙成像与全光学生理学平台的构建
1 引言
高通量、单细胞分辨率的神经元活动分析对于理解大脑功能和模拟神经系统疾病至关重要，但现有方法常受限于可扩展性和手动工作流程。传统的电生理技术，如膜片钳记录和多电极阵列，虽然是功能研究的金标准，但其有限的可扩展性、通量和空间分辨率制约了其在异质神经群体大规模研究中的应用，特别是在患者来源的干细胞模型中。基因编码的钙离子指示剂(GECIs)彻底改变了神经元活动的功能成像，能够以单细胞分辨率对大群体神经元进行无创记录。当与光遗传学效应器结合时，这些技术使得全光学方法能够解析网络连接和突触功能，为研究健康和疾病状态下的神经回路动力学提供了前所未有的机会。
结节性硬化症、CDKL5缺陷症和琥珀酸半醛脱氢酶缺陷症等神经发育障碍，其特点是兴奋性和同步性改变，导致癫痫发生。人类诱导多能干细胞衍生的神经元模型为剖析人类神经元中异常活动提供了独特机会，然而，用于量化大规模群体中网络和单细胞水平活动的可扩展工具仍然有限。此外，大多数GECIs在人类干细胞衍生神经元模型中的应用仍然依赖于对有丝分裂后神经元的病毒转导。虽然病毒递送方便且用途广泛，但需要昂贵的大规模病毒颗粒生产，并可能引入毒性以及在不同生物和技术重复间转导效率的差异。相比之下，通过基因组编辑将GECIs稳定整合到安全港基因座，可以在神经分化早期表达，允许从网络形成的最早阶段记录活动，支持回路成熟的纵向成像和长期药理学干预，同时确保在不同hiPSC系和分化方案之间的一致性。
除了指标表达的技术方面，缺乏稳健、可扩展的采集和分析流程仍然是全光学功能分析在干细胞衍生神经元模型中常规应用的主要障碍。钙成像数据集对可靠的细胞分割、单细胞活动轨迹提取和网络水平动力学的量化提出了独特的挑战。虽然一些软件工具提供了强大的分析功能，但它们通常依赖于手动或半自动分割，或缺乏对体外全光学生理学的适应性。全自动的采集和分析流程，在减少人工输入的同时实现高通量、单细胞分辨率，对于实现这些方法在疾病建模和药物发现方面的全部潜力至关重要。
2 成果
2.1 用于钙成像和全光学分析的干细胞衍生人类神经元的生成
本研究采用两种方法生成兴奋性神经元。一方面，使用慢病毒载体转导hiPSCs，该载体在四环素诱导型启动子下编码人类NGN2，并带有用于选择和富集的嘌呤霉素抗性基因。另一方面，对体外第36天(天)从hiPSCs分化的3D皮层类器官进行形成和解离。为了支持两种分化神经元的成熟，将它们与hiPSC来源的星形胶质细胞共培养约50天。在hNGN2分化的第21天和基于类器官分化的第50天，用慢病毒构建体转导神经元和星形胶质细胞共培养物，这些构建体编码绿色荧光蛋白(GFP)基钙指示剂GCaMP6s或红移钙指示剂jRCaMP1b，以及光遗传学效应器CheRiff。转导一周后，观察到两种分化方法下GFP和mRuby的稳健、一致表达，证实了成功转导。
为了克服病毒转导可能带来的批次间变异，研究还通过CRISPR-Cas9同源重组，在三个hiPSC系的AAVS1安全港基因座中组成型表达GECI GCaMP6s-GFP。第一个细胞系来自一名TSC患者，其TSC2基因外显子40有18bp框内缺失。第二个细胞系源自患者细胞系，并利用TALEN技术在TSC2的第二等位基因上诱导了移码突变，模拟了TSC中观察到的功能缺失。最后，利用CRISPR-Cas9生成了第三个同基因对照hiPSC系。通过PCR确认了GCaMP6s表达盒在AAVS1位点成功敲入，并通过分析多能性标记物SSEA4、OCT4、Nanog和TRA-1-60的表达验证了多能性的维持，且未检测到核型异常。最后，在分化神经元中检测到GFP信号，证明了GCaMP6s的稳健表达和其在安全港基因座的精确整合。
2.2 用于钙成像和光遗传学的模块化采集平台
研究团队开发了一个开源采集平台，包含三个关键特性：可定制的多维采集接口、光遗传学刺激控制和基于Slackbot的远程采集控制。该平台允许在多孔板中进行大规模、自动化的成像实验，具有高重复性和最少的人工干预。
平台基于Micro-Manager生态系统构建，利用其广泛的硬件兼容性。为了解决Micro-Manager在Java架构中对同步刺激、实时分析和Python工作流的支持限制，研究使用pymmcore-plus库开发了模块化图形用户界面，提供了对Micro-Manager C++核心的Python原生接口。这使得快速定制、与现代分析工具无缝集成以及对采集工作流程的直接控制成为可能。利用pymmcore-plus、pymmcore-widgets和useq-schema，开发了micromanager-gui，一个为钙成像和光遗传学实验定制的可扩展GUI。该软件与标准的Micro-Manager配置文件完全兼容，允许用户在不修改现有显微镜设置的情况下采用该平台。
为了支持精确的光遗传学刺激，开发了专用的基于Arduino的LED脉冲控制模块，可编程控制脉冲定时、持续时间和强度。通过在样品平面的光阑和后焦平面的运动学安装的镜子实现空间靶向，可以将刺激限制在成像视野的特定子区域。多维采集实验可以通过MDAWidget配置，支持标准成像模式，包括多通道、延时、Z轴堆栈、多位置和网格采集。该小部件允许保存和重新加载采集设置，确保跨实验和用户的重复性。硬件自动对焦的集成在长期成像过程中保持跨孔的稳定焦点。为了促进无偏见和可重复的高内涵成像，集成了HCSWizard小部件，支持标准格式的多孔板校准和灵活的视野选择。用户可以选择孔中心、可重复随机或基于网格的视野，为适应不同实验需求提供灵活性，同时保持一致性并减少选择偏差。此外，采用OME-Zarr作为标准输出格式，利用Google TensorStore在采集过程中进行异步、分块数据写入，从而无需内存限制即可高效捕获大型时间序列数据集，并确保与可扩展的、基于Python的分析流程兼容。用户还可以启用实时分割，在单独进程中运行Cellpose以检测每个视野中的神经元用于下游分析。此外，集成了Slack API和Slackbot功能，实现对记录进度的远程控制和监控，提高了效率和生产力。
2.3 通过cali进行集成数据探索与分析
研究团队开发了cali，一个交互式的基于Python的图形界面，可以直接集成到micromanager-gui中，以简化对采集的钙成像数据集的探索和分析。cali可以在直观的环境中对多孔板成像实验进行可视化、分割和定量分析。加载数据集后，cali呈现交互式孔板布局，允许用户导航单个孔并快速访问相关视野。对于每个视野，可以显示完整的时间序列，以便直接检查单视野分辨率下的时空钙动力学。为了实现单细胞分析，集成了基于Cellpose的分割界面，能够处理所有或选定的孔和视野。研究最初应用内置的Cellpose Cyto3模型，随后通过用标记图像训练来提高其分割精度。在包含参考实例掩码的25张图像测试集上定量评估了自定义训练的Cellpose 3模型的性能改进。计算了Dice、全景质量(PQ)、SoftPQ和平均精度(mAP)。观察到自定义模型在所有指标上的准确性均有显著提高。Cellpose 3模型获得的Dice为0.5317，PQ为0.4025，SoftPQ为0.4198，mAP为0.1932。自定义的Cellpose 3模型获得了更高的分数：Dice 0.8869，PQ 0.8776，SoftPQ 0.8795，mAP 0.7829。SoftPQ相较于PQ略有增加，说明存在少量分割不足的情况。此外，自定义的Cellpose 3模型在整个测试集上表现出较低的相关标准差，表明与通用模型相比具有更高的鲁棒性和一致性。分割后，生成的掩码与数据集一起存储，并作为后续单细胞钙分析的基础。
研究中展示两个具有不同神经元活动水平的代表性视野，以演示cali的用法。分割后，cali可以执行钙成像分析流程，该流程使用OASIS算法为每个分割神经元提取原始和去噪的钙轨迹，并在计算ΔF/F0后检测钙瞬变。检测到的事件可以可视化为光栅图，其中每一行代表一个单独的神经元。cali可以进一步计算不同的指标，包括每个视野的去噪ΔF/F轨迹的皮尔逊相关性矩阵，将其用作群体水平连接性的度量。在低同步性示例中，相关性矩阵显示出较低的皮尔逊相关性中位数(0.012)，而高同步性视野则显示出显著更高的相关性中位数(0.743)，反映了网络范围相关性的增加。
作为概念验证，研究使用AMPA和NMDA受体拮抗剂CNQX和D-APV，以及已知可增强网络兴奋性的腺苷受体拮抗剂咖啡因，对神经元活动进行药理学调节。采集和分析流程可靠地识别了跨视野的兴趣区域，并量化了核心活动特征，包括响应这些扰动的峰值振幅和事件频率。咖啡因处理与基线相比显著增加了钙事件频率，与网络兴奋性增强一致。相反，用CNQX/D-APV进行突触阻断导致事件频率显著降低和事件振幅显著下降，与有效的兴奋性突触传递抑制一致。这些结果共同证明了该流程在检测神经元网络活动响应药理学操作时的增加和减少方面具有敏感性和鲁棒性。
2.4 光诱发活动的量化
研究进一步扩展了cali，增加了诱发活动分析模式，旨在量化单细胞和网络水平上对光遗传学刺激的神经元反应。研究对共表达CheRiff和jRCaMP1b的hiPSC衍生神经元的一个子区域进行光学刺激，同时在完整视野记录活动。正如先前报道，连续的绿色激发光不会激活CheRiff，确保观察到的诱发反应完全由蓝光刺激驱动。为了实现空间分辨分析，cali集成了刺激掩模，根据其相对于刺激区域的位置自动对兴趣区域进行分类。亚区域特异性刺激允许在同一视野内分离被刺激和未被刺激的神经元群体，从而能够在刺激后直接比较局部和网络范围的活动。研究展示了所有按被刺激和未被刺激分类的去噪ΔF/F轨迹，并叠加了检测到的钙事件/峰值。
从单个兴趣区域提取荧光信号，从元数据中叠加刺激定时以检测刺激诱导的钙瞬变，并从归一化的去噪ΔF/F轨迹量化诱发响应振幅。然后使用cali，通过计算去噪ΔF/F轨迹的成对皮尔逊相关性矩阵并进行空间排序分析，来量化光遗传学刺激的连接性。量化了位于刺激区域内和同一视野中未被刺激神经元之间的功能相关性。当计算整个记录期间的相关性时，被刺激神经元比未被刺激神经元表现出更高的中位数相关值(0.879 vs. 0.736)，全局中位数相关性为0.775，表明整体网络同步性强。当将分析限制在刺激窗口时，整个神经元群体的功能相关性显著增加。在这些时期，被刺激和未被刺激的神经元都显示出较高的中位数相关值，全局中位数相关性为0.923。相比之下，当计算非刺激期间的相关性时，网络相关性相对于刺激时期下降。在这些条件下，被刺激的神经元保持了中等相关性，而未被刺激的神经元表现出较大的相关性降低，全局中位数相关性为0.730。这些结果表明，cali解析了功能连接性的动态、状态依赖性变化，并将基线网络结构与瞬态刺激诱导的同步区分开来。为了进一步证明这种能力，研究根据辐照度绘制了诱发响应振幅，发现被刺激神经元在所有辐照度水平上始终表现出更高的响应振幅，在约48 mW cm-2附近达到饱和，而未被刺激的神经元显示出较弱的响应，这与网络传播一致。最后，作为概念验证，评估诱发活动流程对药理学诱导的网络兴奋性变化的敏感性，使用CNQX和D-APV以及咖啡因调节突触传递。与载体对照相比，突触阻断显著降低了未被刺激神经元的钙响应，表明网络介导的活动受到抑制。相反，咖啡因增强了未被刺激神经元的响应，反映了兴奋性和网络耦合的增加。这些结果共同证明，cali能够稳健量化光遗传学诱发的单细胞响应，同时捕获网络水平的动力学及其对药理学扰动的调节。
2.5 在疾病建模中的应用
为了验证采集和分析流程在不同神经发育障碍模型中的鲁棒性和通用性，将其应用于TSC、CDD和SSADHD的模型，采用了互补的GECI表达策略、指示剂类型和神经元分化方案。对于TSC，在TSC2+/+、TSC2+/?和TSC2?/?背景下，生成了具有稳定GCaMP6s整合到AAVS1安全港基因座的同基
