NFIB的相分离通过SLC3A2抑制去势抵抗性前列腺癌铁死亡：机制探索与治疗新策略

《Advanced Science》：Phase Separation of NFIB Suppresses SLC3A2-Mediated Ferroptosis in Castration-Resistant Prostate Cancer

本文揭示了转录因子NFIB在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）中通过液-液相分离（LLPS）调控SLC3A2表达，从而抑制铁死亡的新机制。研究表明，NFIB在CRPC中高表达，其N端和C端的固有无序区（IDR）驱动其形成核凝聚体。SIRT7依赖的去乙酰化修饰调节NFIB在K65位点的乙酰化，从而调控凝聚体的动态特性。K65突变会降低凝聚体的流动性，减弱NFIB对SLC3A2的转录激活，进而增强肿瘤细胞的铁死亡敏感性。体内实验证明，联合抑制NFIB与诱导铁死亡可显著抑制CRPC肿瘤生长。该研究为CRPC的治疗提供了新的潜在靶点和联合治疗策略。

　　

不同前列腺癌细胞对铁死亡的敏感性存在差异

研究首先比较了激素敏感性前列腺癌（HSPC）细胞（如VCaP、LNCaP）与去势抵抗性前列腺癌（CRPC）细胞（如DU145、PC3）对铁死亡诱导剂erastin的敏感性。结果显示，CRPC细胞对erastin诱导的细胞死亡更为敏感，并表现出更高水平的活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）和Fe²⁺积累。然而，转录组分析和基因集富集分析（GSEA）发现，尽管CRPC细胞对铁死亡敏感，但其内部同时激活了抗铁死亡通路。热图分析显示，作为System Xc^-关键亚基的SLC3A2在CRPC细胞中表达上调，这一现象在临床CRPC组织样本中也得到验证。

NFIB抑制CRPC细胞中erastin诱导的铁死亡

研究团队此前发现转录因子核因子I/B（NFIB）在CRPC细胞中高表达。本研究发现，NFIB在CRPC细胞系和组织中均显著上调。通过CRISPR-Cas9技术构建NFIB稳定敲除的DU145和PC3细胞，发现NFIB敲除增强了erastin诱导的铁死亡，表现为细胞死亡率增加，以及Fe²⁺、MDA和ROS水平进一步升高。反之，过表达NFIB则使CRPC细胞对铁死亡产生抵抗。透射电镜和线粒体追踪染色显示，NFIB敲除联合erastin处理诱发了典型的铁死亡线粒体形态学改变，如线粒体皱缩、膜密度增加和嵴结构破坏。

NFIB直接结合SLC3A2启动子区域并促进其转录

为探究NFIB调控铁死亡的机制，研究人员检测了多个铁死亡调控基因的表达，发现SLC3A2的表达在NFIB敲除后显著降低。生物信息学分析显示，NFIB与SLC3A2在前列腺癌组织中表达呈正相关。通过JASPAR数据库预测和染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）数据分析，在SLC3A2启动子区发现了潜在的NFIB结合位点。ChIP-qPCR实验证实NFIB结合在SLC3A2启动子的特定区域（P3位点）。双荧光素酶报告基因实验进一步证明，NFIB能激活SLC3A2启动子活性，而该位点突变或NFIB敲除会减弱此活性。机制上，NFIB通过转录激活SLC3A2来抑制铁死亡，因为SLC3A2敲低可逆转NFIB过表达所带来的铁死亡抵抗表型，恢复高水平的ROS、MDA和Fe²⁺。同时，NFIB-SLC3A2轴也调控着细胞内谷胱甘肽（GSH）的水平。

NFIB在CRPC细胞中发生液-液相分离

共聚焦显微镜观察发现，内源性NFIB在CRPC细胞核内呈不均匀的点状分布，与相分离凝聚体的特征一致。临床样本的免疫荧光也证实NFIB在CRPC组织中高表达且呈核内液滴样分布。利用PONDR工具预测，NFIB的N端（1-69位氨基酸）和C端（173-495位氨基酸）存在固有无序区（IDR）。通过构建一系列EGFP标记的NFIB截断突变体并转染PC3细胞，系统分析了各结构域在相分离中的作用。结果显示，C端IDR对于NFIB凝聚体的形成和核定位至关重要，而N端IDR对于维持凝聚体的高效形成是必需的，但DNA结合/二聚化结构域（MH1，69-173位氨基酸）则非相分离所必需。荧光漂白恢复（FRAP）实验表明，能形成凝聚体的全长的EGFP-NFIB和缺失MH1结构域的突变体（EGFP-NFIBΔ69-173）均表现出快速的荧光恢复，证实了其凝聚体具有液体样动态特性。此外，NFIB凝聚体的形成对环境敏感，如pH值和温度变化可影响其形成与溶解，且能被1,6-己二醇处理所破坏，进一步支持了其相分离本质。

N端IDR中K65位点的乙酰化调控NFIB的相分离

为了探究NFIB相分离的翻译后调控机制，研究对CRPC细胞中内源性NFIB进行了免疫共沉淀和质谱分析，在其N端IDR内鉴定出三个关键修饰位点：S63磷酸化、K65乙酰化和K69泛素化。通过构建相应的点突变体（S63A， K65A， K69A）发现，只有K65A突变会显著降低NFIB凝聚体的流动性（FRAP恢复变慢），而S63A和K69A突变则无此影响，表明K65乙酰化是维持NFIB凝聚体动态流动性的关键。免疫共沉淀实验证实NFIB在CRPC细胞中被乙酰化，且K65突变降低了其乙酰化水平。通过使用去乙酰化酶抑制剂处理细胞，发现SIRT家族（而非HDAC家族）的抑制剂NAM可增加NFIB的乙酰化水平。进一步的FRAP实验显示，SIRT家族激动剂NMN处理会降低野生型NFIB凝聚体的流动性，但对K65突变体无效，表明K65是SIRT7调控NFIB相分离动态的关键靶点。

NFIB的液-液相分离是其抑制铁死亡功能所必需的

功能回复实验证实，NFIB的相分离能力与其抗铁死亡功能直接相关。在NFIB敲除的CRPC细胞中，回补能形成正常凝聚体的全长NFIB或缺失MH1结构域的突变体，可以恢复SLC3A2的表达并抵抗erastin诱导的铁死亡（表现为MDA、ROS和Fe²⁺水平降低）。相反，回补缺失N端IDR、缺失整个N端（包含IDR和MH1）、或缺失C端IDR的突变体，则无法恢复SLC3A2的表达，且细胞对铁死亡依然敏感。同样，K65乙酰化位点的突变也削弱了NFIB的抗铁死亡功能，SIRT7抑制剂NAM处理可提升野生型NFIB细胞的SLC3A2表达并增强铁死亡抵抗，但对K65突变体细胞无效。这些结果表明，由C端IDR驱动形成、并由N端IDR（特别是K65乙酰化）维持动态流动性的NFIB核凝聚体，是其有效激活SLC3A2转录、进而抑制铁死亡的结构基础。

SIRT7是调控NFIB去乙酰化的重要蛋白

为寻找调控NFIB K65乙酰化的上游去乙酰化酶，研究聚焦于核内SIRT家族成员。免疫共沉淀实验显示，NFIB与SIRT6和SIRT7存在相互作用，而与SIRT1无相互作用。功能实验表明，在CRPC细胞中敲低SIRT7（而非SIRT6）会导致NFIB乙酰化水平升高，并伴随SLC3A2蛋白表达上调。同时，敲低SIRT7可降低细胞内的MDA、ROS和Fe²⁺水平，增强细胞对铁死亡的抵抗。这些结果确定了SIRT7是调控NFIB去乙酰化的关键酶，并建立了SIRT7-NFIB-SLC3A2调控轴。

靶向NFIB联合铁死亡诱导剂在体内抑制肿瘤生长

最后，研究评估了靶向NFIB联合铁死亡诱导剂的治疗潜力。在裸鼠皮下种植NFIB稳定敲除的DU145细胞构建荷瘤模型，并分组给予erastin治疗。结果显示，与对照组或单一治疗组相比，NFIB敲除联合erastin治疗能最显著地抑制肿瘤生长，并导致肿瘤内MDA含量（脂质过氧化标志物）最高，SLC3A2表达最低。此外，在尾静脉注射构建的实验性转移模型中，NFIB敲除同样抑制了CRPC的转移负荷，并增强了erastin的抗转移效果。重要的是，治疗未引起小鼠明显的全身毒性。这些体内实验证实，靶向抑制NFIB能够与铁死亡诱导剂产生协同抗肿瘤效应。

综上所述，本研究首次揭示了转录因子NFIB通过液-液相分离这一生物物理机制，在细胞核内形成动态凝聚体，从而高效转录激活抗铁死亡基因SLC3A2，驱动CRPC对铁死亡的抵抗。SIRT7介导的NFIB K65去乙酰化精确调控了凝聚体的流动性，进而影响其转录活性和铁死亡抑制功能。该研究不仅阐明了CRPC中铁死亡调控的新机制，也为临床上难以治疗的CRPC提供了潜在的治疗新靶点，即通过破坏NFIB的