《Journal of Hazardous Materials》：Title: Cognitive effects of chlorantraniliprole alone or in mixture with a pyrethroid in honey bees
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氯安Transformation亚致死剂量显著影响蜜蜂习惯化和嗅觉辨别能力，并与吡虫啉产生协同毒性效应，提示低剂量CAP污染可能损害蜜蜂寻花能力，威胁授花服务。
作者：Lo?c Colin-Duchevet、Apolline Sangely、Pierre Charnet、Jean-Christophe Sandoz
所属机构：法国国家科学研究中心（CNRS）、法国农业与食品研究院（IRD）、巴黎萨克雷大学（UMR9191）、吉夫-苏尔-伊维特
摘要
氯虫腈是一种双酰胺类杀虫剂，作用于昆虫的瑞诺丁受体，这些受体参与神经元和肌肉中的钙离子释放。钙离子的释放会触发神经递质的胞吐作用和肌肉收缩。尽管这些受体存在于神经元中，但该杀虫剂对认知功能的可能影响尚未得到研究。蜜蜂是重要的传粉者，通过研究其食欲性学习行为，可以为昆虫认知提供宝贵的模型。本研究评估了氯虫腈对蜜蜂嗅觉感知、学习和记忆的亚致死效应。由于蜜蜂在觅食过程中会接触到多种杀虫剂，因此我们研究了氯虫腈单独使用或与拟除虫菊酯类杀虫剂联合使用时的潜在协同效应。为此，我们利用了蜜蜂触角伸展反应（Proboscis Extension Response, PER）的条件反射实验，来评估杀虫剂对蜜蜂认知多个方面的影响。非联想学习通过PER的习惯化过程进行评估，而联想学习和嗅觉泛化则通过绝对条件反射进行评估。最终，通过差异性条件反射实验测量了蜜蜂的嗅觉辨别能力。结果表明，氯虫腈显著影响了蜜蜂的习惯化和嗅觉辨别能力。两种杀虫剂联合使用时，既出现了拮抗效应，也出现了协同效应。这些结果表明，低剂量的氯虫腈可能对蜜蜂在觅食过程中寻找有益花源的能力产生负面影响，从而影响其传粉功能。
引言
氯虫腈（CAP）属于邻氨基苯二甲酰胺类杀虫剂，是市场上最新的农作物保护产品之一，可有效防治鳞翅目和鞘翅目等害虫[1]、[2]、[3]。该化合物特异性地作用于瑞诺丁受体（RyRs），这类受体在脊椎动物和无脊椎动物的神经元及肌肉组织中普遍存在[4]。瑞诺丁受体的激活会引发细胞内钙离子释放。在肌肉细胞中，钙离子从肌浆网释放出来，导致原肌球蛋白构象变化，促进肌动蛋白-肌球蛋白相互作用，从而引发肌肉收缩；在神经元中，钙离子从突触附近的内质网释放，使神经递质囊泡与磷脂膜融合，导致神经递质在突触处释放。氯虫腈被设计用于专门作用于肌肉组织中的瑞诺丁受体[5]，因此相关研究主要关注其对肌肉功能（如运动和飞行）[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]以及繁殖成功和生命周期（如胚胎后期发育和后代存活率）[6]、[13]、[14]、[15]、[16]的负面影响。然而，最新研究表明氯虫腈也可能影响神经过程。例如，Kimura等人[17]发现氯虫腈处理会增强小鼠的恐惧行为；Christen和Fent[18]发现该杀虫剂会改变蜜蜂大脑中的基因表达，尤其是与乙酰胆碱受体、P450酶和卵黄蛋白相关的基因[18]。这些发现支持氯虫腈会影响脊椎动物和无脊椎动物神经细胞的假设。不过，氯虫腈对认知功能的直接影响尚未得到充分研究。
为了评估氯虫腈对神经功能的影响，使用亚致死剂量进行行为实验至关重要。蜜蜂是研究昆虫认知的理想模型，因为它们能够学习各种视觉、嗅觉和味觉线索，并在觅食时利用这些信息[19]。除了出色的学习能力外，蜜蜂在农业和生态学中也扮演着关键角色，因为它们参与了大多数被子植物的授粉过程[20]、[21]、[22]、[23]。然而，由于栖息地丧失、新出现的疾病、寄生虫以及农药使用的增加带来的化学污染等多种环境压力因素，全球蜜蜂种群数量正在下降[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。因此，本研究的首要目的是评估亚致死剂量的氯虫腈对蜜蜂感官和学习能力的影响。
在现实中，蜜蜂和昆虫通常不会只接触一种外源性物质，而是会接触到多种不同的分子（通过分析蜜蜂产品或昆虫本身可以证实这一点[30]、[31]、[32]。多种杀虫剂的共同作用可能导致难以预测的“协同效应”[24]。氰戊菊酯（CYP）是欧洲使用最广泛的拟除虫菊酯类杀虫剂之一，这是在新烟碱类杀虫剂被禁用后的替代品[33]、[34]。它可用于防治双翅目、鳞翅目、膜翅目、直翅目和半翅目等多种害虫[33]、[35]、[36]、[37]。这种杀虫剂作用于神经元中的电压依赖性钠通道，导致膜长时间去极化[38]、[39]。由于其广泛应用，已有大量研究探讨了CYP对非目标物种的亚致死效应[40]、[41]、[42]，包括基因表达改变[18]、[43]、[44]、[45]、蜂王统治力的下降[46]、运动能力下降[46]以及觅食行为和学习能力的变化[47]、[48]、[49]。本研究的第二个目的是评估氯虫腈和氰戊菊酯的联合效应，因为这两种杀虫剂分别占全球杀虫剂市场的13%（双酰胺类）和16%（拟除虫菊酯类），而新烟碱类杀虫剂在2018年占据了最大市场份额（25%）[50]。
首先，我们进行了死亡率实验，以确保杀虫剂溶液的质量，并确定具有实际应用价值的亚致死剂量[51]。确定这些剂量后，我们进行了行为实验，评估氯虫腈单独使用或与氰戊菊酯联合使用对蜜蜂感知和学习能力的影响。实验采用触角伸展反应（PER）范式，包括非联想和联想任务[52]、[53]。任务1旨在确定杀虫剂处理是否改变了蜜蜂对蔗糖的敏感性；任务2涉及简单的非联想学习过程，测试了蜜蜂对触角伸展反应的习惯化和去习惯化现象；我们还使用了两种联想条件反射协议。任务3是简单的绝对条件反射实验，要求蜜蜂将某种气味（条件刺激-CS）与蔗糖奖励（无条件刺激-US）关联起来；随后通过差异性条件反射实验评估了蜜蜂的嗅觉记忆和嗅觉泛化能力；任务4是最复杂的，通过两种相似的二元混合物进行差异性条件反射实验，其中一种混合物受到奖励（CS+），另一种则不受奖励（CS-）。本研究中使用的气味物质属于植物挥发物[54]，这些气味物质在蜜蜂的嗅觉学习研究中已被广泛使用[55]、[56]、[57]、[58]。
亚致死剂量的确定
作为第一步，我们进行了死亡率实验，以验证实验条件下氯虫腈和氰戊菊酯的急性毒性是否与先前报道的LD50值一致[51]、[59]。该实验还帮助我们确定了适合行为研究的亚致死剂量。实验使用的蜜蜂来自法国吉夫-苏尔-伊维特的IDEEV养蜂场，该养蜂场周围没有施用杀虫剂。
讨论
本研究的目的是确定氯虫腈（一种新型邻氨基苯二甲酰胺类杀虫剂）单独使用或与拟除虫菊酯联合使用是否会影响蜜蜂的嗅觉感知、学习和记忆。为此，我们对处理过的蜜蜂和对照组蜜蜂进行了四项实验任务。
研究的第一阶段旨在确定适合行为实验的亚致死剂量，并验证杀虫剂的质量。
环境影响声明
氯虫腈属于双酰胺类杀虫剂，这类杀虫剂占全球杀虫剂市场的13%。虽然已知这类物质会对昆虫的运动、基因表达和繁殖产生亚致死效应，但其对认知功能的影响尚未得到充分研究。本研究探讨了亚致死剂量和实际应用剂量是否会对关键传粉者——蜜蜂的认知能力产生负面影响。
资金来源
本研究由法国国家研究机构（ANR）通过“Synaptic-Bee”项目资助（项目编号：ANR-20-CE34-0017）。
作者贡献声明
Jean-Christophe Sandoz：撰写、审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法论制定、资金获取、概念构思。
Pierre Charnet：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法论制定、资金获取、概念构思。
Apolline Sangely：实验研究。
Lo?c Colin-Duchevet：初稿撰写、方法论制定、实验研究、数据整理、概念构思。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在撰写过程中，作者使用了Deepl和ChatGPT工具来提高文章的可读性。使用这些工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本文研究的财务利益或个人关系。Jean-Christophe Sandoz表示获得了法国国家研究机构的资金支持。如果还有其他作者，他们声明没有其他可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢Sabrina Bothorel在养蜂工作中的技术协助，同时感谢Alizée Delarue和Camille Faber提供用于图形摘要的蜜蜂图片。
