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这篇原创研究论文（非综述）报道了一种名为MNGE（Multi-targeting Non-specific Genome Engineering）的通用性基因组工程新方法。该方法基于多靶向整合酶（MTIs）系统，可在大范围革兰氏阳性菌（如链霉菌）和革兰氏阴性菌（如伯克霍尔德菌）中，实现代谢基因或大型生物合成基因簇（BGCs，可达106 kb）的多拷贝（至少3个拷贝）、高度随机（仅需核心TT二核苷酸）的染色体整合与稳定表达。通过将UK-2（前体为杀菌剂芬哌酰胺）、多醚类抗生素沙利霉素和Gq/11信号通路抑制剂FR900359的BGCs异源表达于不同细菌宿主，并利用染色体位置效应，本研究显著提高了这些高价值化合物的发酵产量，展示了MNGE技术在下一代细菌基因组工程和微生物细胞工厂构建中的广阔应用前景。
1 引言
基因组工程在代谢工程和合成生物学中扮演着关键角色，用于生物燃料、化学品、药物等高价值化合物的工业生产。与基于质粒的系统相比，染色体整合能够克服种群异质性，具有固有的遗传稳定性，可降低代谢负担，特别适用于大规模和长期发酵。不同于同源重组（HR）或转座子介导的DNA整合，大丝氨酸重组酶（LSRs）驱动的位点特异性整合具有一个天然的机制优势，即对供体DNA的大小没有明显的上限限制，这尤其适合基因组插入大型代谢途径。然而，LSRs的实际应用受到整合效率低、已鉴定的LSR数量有限以及序列定义的着陆位点（attB位点）的限制。为了克服这些限制，亟需开发通用、宿主不依赖的基因组工程工具，以便在多种细菌中实现功能性基因或大型代谢途径的染色体稳定表达。有趣的是，少数LSRs进化出了多靶向或转座能力，使其能够在给定的细菌基因组中靶向可变的attB位点，即多靶向整合酶（MTIs）。最近的研究已在人类细胞中鉴定出一个独特的MTI谱系。本研究的目的是将MTI系统从人类细胞扩展到细菌，用于功能性基因或大型代谢途径的随机染色体整合与稳定表达。
2 结果
2.1 MNGE的设计与构建
为了开发用于细菌中代谢基因或途径多靶向、非特异性整合的MNGE方法，研究首先选择了四种MTI进行实验验证。在模式菌株天蓝色链霉菌J1074中，MTI_1737、MTI_2871和MTI_6538系统成功实现了外源DNA的整合，尽管其整合效率低于位点特异性整合酶PhiC31。其中，MTI_2871的整合效率最高，且对其天然靶标attB位点的特异性最为宽松，因此被选为基础，并重命名为MTI1，用于构建MNGE方法。
MNGE方法不同于先前开发的MSGE（基于“一个LSR-多个人工attB位点”概念）和aMSGE（基于“多个LSR-多个天然attB位点”概念）方法。MSGE需要耗时多轮预装人工attB位点，而aMSGE仅适用于放线菌。基于“一个MTI-多个天然attB位点”概念的MNGE方法，理论上无需预装attB位点，即可在放线菌以外的多种细菌中实现多靶向、非特异性整合。
2.2 利用MNGE实现功能基因的多靶向、非特异性整合
生物信息学分析显示，MTI1系统可在天然宿主中实现移动遗传元件（MGEs）至少双拷贝的整合。为了验证MTI1系统能否介导外源基因的染色体整合，研究使用编码蓝色色素靛蓝的基因盒idgS-sfp作为报告系统。结果表明，非特异性整合质粒pMTI-idgS可高效整合到三种模型链霉菌宿主中。对整合位点进行全基因组测序发现，idgS-sfp以随机方式插入J1074基因组，最高可达三拷贝整合。MTI1系统在J1074中的attB序列特异性比在天然宿主中更宽松，仅保留了保守的TT二核苷酸核心。多拷贝整合与染色体位置效应的结合，可有效提高功能基因的表达水平。
2.3 利用MNGE在链霉菌中实现大型天然产物BGCs的非特异性整合
研究将MNGE方法扩展到大型代谢途径（即天然产物BGCs）的工程化，以优化两种重要抗生素的产量。首先，针对新型杀菌剂芬哌酰胺的前体UK-2A，从一个新的产UK-2菌株中克隆了完整的UK-2 BGC（41 kb）。在异源宿主天蓝色链霉菌J1074中成功表达了该BGC。当通过PhiC31系统整合一个拷贝时，工程菌株的UK-2产量达到262.1 mg/L；整合两个拷贝时，产量提升至449.2 mg/L，是原始生产菌株的7倍。
随后，研究将UK-2 BGC中的PhiC31系统替换为MTI1系统，并将其引入J1074。在10个外接合子中，有3个工程菌株的UK-2产量高于单拷贝PhiC31整合菌株，其中最高的达到357.1 mg/L。全基因组测序证实，UK-2 BGC以单拷贝形式随机整合在染色体不同位置，初步显示了MNGE基于染色体位置效应提高产量的能力。此外，研究还尝试在已含有双拷贝UK-2 BGC的菌株中引入第三个拷贝。在100个外接合子中，筛选到9个产量更高的菌株，其中最高的UK-2产量达到590.3 mg/L，比双拷贝菌株提高了31.4%。
研究进一步测试了MTI1系统对更大尺寸天然产物BGC的整合能力，使用了多醚类抗生素沙利霉素的人工BGC（106 kb）。在15个外接合子中，有5个工程菌株的沙利霉素产量高于对照菌株。其中产量最高的菌株沙利霉素产量达到2.1 mg/L，是对照的5.3倍。全基因组测序同样证实了沙利霉素BGC的单拷贝随机整合。
这些结果证明，MNGE方法可高效实现大型代谢途径在链霉菌中的非特异性基因组整合，与经典位点特异性整合系统的定点整合不同，其非特异性整合特性有望广泛应用于基于染色体位置效应优化大型代谢途径在多种细菌中的表达。
2.4 将MNGE扩展到多种革兰氏阳性放线菌
研究进一步测试了MTI1系统在不同重要的工业链霉菌以及非链霉菌放线菌中的适用性。结果表明，三种MTI1系列质粒可成功引入氯霉素产生菌、表柔比星产生菌和阿维菌素产生菌等工业链霉菌菌株。此外，在遗传操作困难的刺糖多孢菌中，MTI1系统也实现了成功整合，且效率优于链霉菌来源的某些启动子。这些结果表明，MTI1系统可广泛应用于多种工业链霉菌和非链霉菌稀有放线菌，为在这些缺乏已知位点特异性整合系统的细菌中表达功能基因或代谢途径提供了便利。
2.5 优化MNGE用于革兰氏阴性菌中FR900359的生产
研究进一步探索了MNGE方法在革兰氏阴性菌中的应用，以伯克霍尔德菌为代表菌株。由于在伯克霍尔德菌中过表达MTI1可能产生明显毒性，研究将强启动子替换为弱诱导型启动子。优化后的MTI1质粒成功引入伯克霍尔德菌，且工程菌株生长良好。
研究将优化的MNGE方法用于在异源宿主伯克霍尔德菌中整合具有高药理活性的环状缩酚酸肽FR900359的BGC（66 kb）。将包含该BGC的质粒引入伯克霍尔德菌后，通过HPLC-HRMS分析发酵样品，证实两个工程菌株成功产生了FR900359。这证明了优化后的MNGE方法可介导大型天然产物BGC的染色体整合，从而在革兰氏阴性菌中实现高价值化合物的生产。
3 讨论
区别于位点特异性LSRs，MTIs进化出了具有宽松序列特异性的转座能力。本研究首次证明至少三种MTI系统可在细菌中实现外源DNA的基因组整合。值得注意的是，MTI1系统能够实现大型代谢途径的非特异性基因组整合，这通常是一般转座酶无法做到的。因此，MTI1系统结合了位点特异性LSRs整合大DNA片段和转座酶非特异性DNA插入的优点。
基于五种梯度强度启动子控制的MTI1系统，本研究展示了MNGE方法的设计、原型构建、实施和应用，可在多种细菌系统中实现代谢基因或途径的多靶向和非特异性基因组整合。高度不保守的attB位点理论上允许MTI1靶向几乎所有细菌及其他生物体的基因组。研究也测试了MTI1系统在另一种缺乏常见位点特异性整合系统的革兰氏阴性菌中的适用性。结果表明，MTI1系统对链霉菌、伯克霍尔德菌和色杆菌均表现出一定程度的毒性，这可能是由于其非特异性整合特性所致。在将来，通过鉴定新型MTI或对已知MTI1系统进行定向进化，开发毒性更低、整合效率更高的通用MTI系统，对于MNGE方法的广泛应用具有重要意义。
最后，本研究证明了MNGE方法在多种细菌宿主中进行下一代基因组工程的广
