《Advanced Science》：Development-based In Vivo Bioreactor Strategy for Challenging Senescent Bone Reconstruction
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本文介绍了一种创新的基于发育工程原理的体内生物反应器策略。该方法通过在体植入骨形态发生蛋白-2（BMP-2）负载的生物材料，启动机体固有的发育级联反应，从而“制造”出在体生物反应器源性骨（vBR-Bone）。vBR-Bone重现了天然骨的复杂结构，并展现出逆转衰老的生物学活性。将其与一种可阻挡纤维组织侵入的非对称仿生骨膜结合，vBR-Bone碎片通过“分区化”重塑与整合的方式，成功修复了老年小鼠的大段股骨缺损。本策略为解决自体骨来源不足、衰老骨活性低下及大段负重骨缺损修复困难等临床难题提供了有前景的解决方案。
基于发育的体内生物反应器策略用于修复挑战性的衰老性骨缺损
引言
老年患者的关键性大段骨缺损由于自体骨来源有限、衰老骨功能失调以及纤维组织侵入阻碍愈合，构成了严峻的临床挑战。自体骨移植存在供区并发症、来源有限及老年供体骨生物活性下降等问题。传统的发育工程旨在体外模拟发育过程培养类器官，但面临血管化不足、结构不完整等局限。本研究提出了一种创新的基于发育的体内生物反应器策略，旨在克服上述难题。
结果
1. 体内生物反应器源于BMP-2触发的发育级联反应
将负载BMP-2的明胶海绵植入老年小鼠背部皮下，成功构建了体内生物反应器。该过程重现了包括间充质细胞凝聚、软骨内成骨、骨重塑和骨髓形成在内的系列发育事件。所形成的组织在结构上复现了天然股骨，包含皮质骨、骨小梁和骨髓龛，因此被命名为“体内生物反应器源性骨”（vBR-Bone）。发育过程分析显示，vBR-Bone经历了纤维增殖、软骨内成骨、骨重塑和骨髓形成等连续阶段。在第二至四周，vBR-Bone进入快速发育期，骨密度和骨体积显著增加。
2. 工程化的vBR-Bone展现出衰老过程中丧失的骨生物活性的恢复
与衰老的自体股骨相比，两周大的vBR-Bone含有更少的衰老细胞，但富集了更多的瘦素受体阳性（LepR+）间充质干细胞（MSC）、成骨祖细胞（OSX+）和H型血管（CD31highEMCNhigh），表明其成骨能力更强。此外，vBR-Bone中抗酒石酸酸性磷酸酶阳性（TRAP+）单核破骨前细胞和组织蛋白酶K阳性（CTSK+）破骨细胞数量增多，同时伴随着调节骨重塑的R型血管（EMCN+CAV1+VEGFR3?）的浸润，共同逆转了衰老相关的骨转换下降，形成了高转换的骨重塑微环境。从vBR-Bone中分离的MSC（vBR-MSC）相比从老年小鼠股骨分离的骨髓间充质干细胞（BMSC），表现出更强的自我更新能力、更低的衰老水平以及更优的成骨分化潜能。
3. 仿生骨膜增强成骨并限制成纤维细胞入侵以促进骨再生
为了解决纤维组织侵入的问题，研究通过静电纺丝制备了一种非对称仿生骨膜。该骨膜由聚己内酯（PCL）和磷酸三钙（TCP）构成，具有亲水的内层和疏水的外层。其致密结构可有效延迟成纤维细胞（20-40 μm）的侵入，同时允许毛细血管（约8 μm）的长入。体外实验证实，含10% TCP的PCL仿生骨膜具有良好的生物相容性，并能促进MSC的粘附、成骨相关基因（如COL1A1， BSP）的表达以及碱性磷酸酶（ALP）活性。体内皮下植入也显示了良好的生物相容性。
4. vBR-Bone通过分区化重塑方法修复节段性骨缺损
研究通过同种异体皮下移植和骨缺损部位移植实验，验证了vBR-Bone的可行性与修复功能。将绿色荧光蛋白（GFP）标记的vBR-Bone碎片移植到野生型老年受体鼠体内，vBR-Bone未引起明显免疫排斥，并保持了破骨活性、富含成骨祖细胞和H型血管，能够逐渐重塑为骨小梁结构。在关键的股骨缺损模型中，将vBR-Bone碎片装入仿生骨膜形成复合移植物，进行自体移植。结果显示，vBR-Bone碎片在2周时开始整合，到6周时已重塑为高度有序的骨小梁，有效修复了占股骨干三分之一长度（4mm）的大段骨缺损。而单纯仿生骨膜组或直接植入BMP-2/明胶海绵组均未能实现同等质量的结构性修复。
5. vBR-Bone多因子重建骨重塑微环境
蛋白质组学分析比较了自体移植前（前组）和移植后7天（后组）缺损部位的蛋白表达。结果显示，移植后细胞外基质（ECM）相关通路和“骨重塑”相关条目显著富集。关键的是，与破骨细胞分化（如Itgb3， Dcstamp， Traf6）和骨重塑（如Mmp9， Ctsk）相关的因子在移植后得以维持。同时，成骨相关因子（如Sp7， Runx2， Bmp-2）也维持在或超过移植前水平。组织学验证显示，vBR-Bone/仿生骨膜治疗组在修复期间持续存在TRAP+破骨细胞和丰富的R型血管，表明缺损部位成功重建了一个活跃的骨重塑微环境。
6. vBR-Bone释放的TGF-β1通过TRAF6依赖的泛素化激活PI3K/AKT/mTOR通路以促进修复
进一步对比vBR-Bone/仿生骨膜组与单纯仿生骨膜组的蛋白质组发现，前者显著富集了“TGF-β受体信号通路正调控”等条目。其中，转化生长因子-β1（TGF-β1）及其受体（Tgfbr1）的丰度显著更高。酶联免疫吸附试验（Elisa）证实了vBR-Bone组缺损部位TGF-β1浓度更高。通路分析显示PI3K-Akt和mTOR通路被激活，蛋白印迹（Western blot）进一步证实了PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平升高。研究排除了胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的主要作用。机制上，TGF-β1与受体结合后，募集肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），后者通过催化PI3K-p85α的K63连接的多聚泛素化，进而激活PI3K/AKT/mTOR信号轴，驱动强烈的成骨作用，从而修复骨缺损。
讨论
本研究提出的体内生物反应器策略，与传统体外发育工程不同，直接以生物体自身为“反应器”，通过BMP-2启动程序性发育过程，生成了具有完整血管网络和骨髓结构的真实骨组织。vBR-Bone展现出“年轻化”的表型，解决了衰老自体骨活性不足和来源有限的核心问题。结合可阻挡纤维组织、允许血管长入的仿生骨膜，vBR-Bone碎片通过“分区化”方式实现了大段负重骨缺损的功能性重建。从机制上，vBR-Bone在缺损部位重建了一个高转换的骨重塑微环境，并通过释放TGF-β1激活PI3K/AKT/mTOR通路来驱动修复。该策略为临床治疗老年性大段骨缺损提供了具有转化潜力的新方案。当然，该策略的“年轻化”表型的具体表观遗传机制、在大动物模型中的验证、以及长期的生物相容性等问题，仍有待未来研究进一步探索。
结论
这项受发育原理启发的研究，展示了一种创新的体内生物反应器策略。该策略利用BMP-2负载的生物材料激活内源性骨发育程序，生成在结构上和功能上均重现天然骨的vBR-Bone。vBR-Bone逆转了衰老相关的骨活性下降。当将其包裹在可选择性屏障纤维组织的仿生骨膜中时，vBR-Bone碎片能通过“分区化”重塑与整合过程，修复老年小鼠的大段骨缺损。其分子机制涉及vBR-Bone多因子重建骨重塑微环境，并通过基质释放的TGF-β1经TRAF6依赖的泛素化激活PI3K/AKT/mTOR轴，从而驱动有力的成骨作用。该策略成功克服了自体骨移植的短缺与衰老相关功能障碍，为修复具有挑战性的年龄相关性大段骨缺损提供了一种可临床转化的生物学解决方案。
