《Advanced Science》：G4-Ligand-Directed PROTACs Unveil DR1 as a Novel Ligand-Co-Binding G4-Protein and Reshape G4-Dependent Transcription
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本文推荐一种称为G4-配体导向的蛋白水解靶向嵌合体（G4-Ligand-Directed PROTACs, G4L-TACs）的创新化学平台，该平台将高亲和力G4配体与E3泛素连接酶募集剂耦合，用于选择性降解与配体共结合的四链体结合蛋白（G4BPs）。研究利用此平台，首次发现了转录因子DR1可被募集到配体稳定的启动子G4上，并通过G4L-TAC介导的DR1降解，揭示了其在富含G4的癌基因启动子处的转录抑制功能，为理解G4配体如何通过调控蛋白质网络来影响基因表达提供了全新视角。
G4-配体导向的PROTACs：发现、验证与转录调控机制研究
1. 引言
G-四链体（G-quadruplexes, G4s）是一种由富含鸟嘌呤的核酸序列形成的非经典、稳定的核酸二级结构，广泛存在于启动子、端粒和非翻译区，在复制、转录和翻译调控中扮演关键角色，并与癌症、神经退行性疾病和免疫紊乱等病理过程相关。G4s的生物学功能主要通过其与G4结合蛋白（G4-binding proteins, G4BPs）的相互作用来实现，这些蛋白质调控着G4的折叠与解旋。尽管已有许多G4BPs被鉴定，但那些在特定小分子配体存在时，能够与G4共结合（ligand-co-binding）的蛋白质亚群仍未得到充分探索。传统的G4配体，如吡啶并吩嗪（Pyridostatin, PDS）、CX-5461、PhenDC3和TMPyP4，被广泛用于稳定G4结构并显示出抗癌活性。然而，越来越多的证据表明，其药理学效应不仅限于简单的G4稳定化，还可能涉及诱导G4形成、扰动G4BP网络以及引发更广泛的应激反应。这种复杂性提示，配体共结合蛋白可能介导了关键的生物学结果，但目前缺乏能够在活细胞中系统性捕获和验证此类蛋白质的工具。
蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）通过劫持泛素-蛋白酶体系统，已革新了靶向蛋白质调控领域。最近的研究将PROTACs与核酸组件（包括适配体和G4寡核苷酸）结合，实现了对核酸结合蛋白的降解，证明了核酸驱动靶向降解的可行性。基于此概念，研究者开发了G4-配体导向的PROTACs（G4L-TACs），它将小分子G4配体转变为一种双功能探针，能够募集并降解那些特异性共结合于配体稳定化G4结构的蛋白质。
2. 结果与讨论
2.1 G4L-TACs的设计、合成与体外表征
研究者通过将高亲和力的G4配体PDS与已建立的E3泛素连接酶募集剂Cereblon（CRBN）或von Hippel-Lindau（VHL）连接，设计了G4L-TACs。研究合成了八种G4L-TACs，并通过优化接头长度和组成，确保其保留了与母体配体PDS相当的G4结合亲和力与稳定化能力。通过荧光淬灭实验和圆二色谱（Circular Dichroism, CD）熔解实验评估，PC2（CRBN）和PV1（VHL）在多种G4拓扑结构（如c-MYC启动子G4、HTG22、HRAS）上均表现出强结合与稳定化能力。这些结果证实，将CRBN/VHL募集剂整合到PDS衍生物中，并不会废除其G4识别能力，从而支持了利用小分子配体作为G4定位元件来构建降解工具的可行性。
2.2 细胞G4结合验证与泛素化蛋白质组学提名候选蛋白
在细胞水平，通过BG4免疫荧光检测证实，PC2和PV1能够显著增加HeLa细胞核内的G4信号，与PDS处理效果相当，表明这些化合物能在细胞内有效结合内源性G4结构。随后，研究者通过泛素化残留蛋白质组学（UbiScan）技术，鉴定在G4L-TACs处理下被特异性泛素化的蛋白质。结果显示，PC2和PV1分别诱导了30个和69个差异泛素化蛋白（differentially ubiquitinated proteins, DUPs），其中7个蛋白在两组数据中重叠。这些DUPs在功能上显著富集于核酸相关因子，包括转录调控因子、RNA加工蛋白和染色质组织相关蛋白。值得注意的是，转录抑制因子DR1和加工体组分LSM14A被鉴定为潜在的候选配体共结合G4BPs。
2.3 DR1被募集到配体稳定的启动子G4并可被G4L-TACs驱动降解
在细胞验证中，PC2和PV1处理可降低DR1蛋白水平，且此降解可被蛋白酶体抑制剂MG132所挽救，证实了其蛋白酶体依赖的降解机制。免疫沉淀实验进一步证实，PC2或PV1处理可增强DR1的泛素化。体外结合实验（ELISA和电泳迁移率变动分析，Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）表明，重组DR1蛋白优先结合G4结构，并且在PDS或G4L-TACs存在时，这种结合进一步增强，支持了配体共结合模型。值得注意的是，DR1本身并不改变G4的体外折叠状态。下拉实验和CUT&Tag谱分析进一步证实，DR1在染色质水平上，特异性富集于启动子附近富含预测或实验验证G4基序的区域。这些数据共同表明，DR1在配体稳定化的背景下被募集到启动子近端G4基序，并且其对G4L-TAC介导的事件驱动型降解敏感。相比之下，已知的G4结合蛋白如DHX36，其结合虽可被PDS阻断，却未被G4L-TACs降解，这突出了G4L-TACs对“配体共结合”蛋白的特异性。
2.4 DR1的降解揭示了在特定富含G4位点的转录结果
功能研究发现，小干扰RNA（siRNA）介导的DR1敲低可减少细胞核G4信号，而过表达则无此效应，结合体外FRET实验数据，表明DR1本身并非自主的G4稳定剂，而可能作为一种情境依赖的辅助因子参与G4的维持。通过整合siDR1转染后的转录组测序（Drug-seq）数据与DR1的CUT&Tag谱，研究者发现DR1的缺失会导致一组选择性差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中96个基因与DR1和BG4的CUT&Tag峰重叠。值得注意的是，这些重叠基因中的大多数在DR1被敲低后表达上调，这与DR1在这些位点发挥G4相关的转录抑制功能一致。代表性基因如c-MYC和KRAS的转录水平在siDR1处理后增加。通路分析进一步显示，这些受影响的基因富集于细胞生长、细胞周期和应激反应等功能集。荧光素酶报告基因实验证实，含有野生型G4基序的启动子构建体在DR1降解后活性增加，而突变G4构建体则无反应。综上所述，DR1被募集到配体稳定的启动子G4，并在该处作为情境依赖的辅助因子，对转录产生抑制作用。通过G4L-TACs选择性去除DR1，揭示了其在调节一部分G4依赖性转录程序中的作用。
2.5 G4L-TAC方法的局限性与展望
尽管G4L-TACs能有效鉴定并降解如DR1等配体共结合蛋白，该方法仍存在一些局限性。首先，与PDS等经典配体相比，G4L-TACs的抗增殖活性较弱，这反映了其分子量、渗透性和作用机制（直接核酸稳定化 vs. 延迟的蛋白质降解）的差异。其次，G4L-TACs并非影响所有已知的G4BPs，例如，其结合可被PDS阻断的G4解旋酶DHX36并未在实验条件下被降解。这强调了G4L-TACs主要靶向一组“配体共结合”蛋白，而非普遍地去除所有G4相关蛋白。此外，PDS骨架的细微修饰可能会深刻地重塑所募集蛋白的谱系，且降解结果还取决于三元复合物的几何构型、E3连接酶的可用性以及靶蛋白的泛素化敏感性。因此，G4L-TAC为基础的分析应被视为一种用于提名候选配体共结合因子的发现导向性方法，而非一份详尽的目标蛋白目录。未来的高分辨率结构表征将有助于阐明此类共结合模式的分子基础。研究还揭示了PDS与DR1之间的功能互作：DR1过表达抑制细胞增殖和c-MYC转录，而敲低DR1则产生相反效应。此外，DR1增强了PDS的活性，而DR1敲低则减弱了该活性。这些发现表明，PDS的部分功能影响可能是通过募集DR1来介导的。展望未来，对连接子组成和E3募集剂的进一步优化，或将其扩展到其他G4配体及RNA G4情境，可能拓宽此策略可触及的蛋白质范围。总体而言，G4L-TACs为在G4结构与相关蛋白质的界面阐明小分子作用机制提供了互补的、机制导向的工具。
3. 结论
G4L-TACs提供了一种事件驱动的策略，用于在活细胞中研究配体共结合的G4相关蛋白。基于PDS的CRBN和VHL配体缀合物在体外和细胞内均保留了G4结合能力，促进了选择性泛素化，并实现了靶向降解以进行功能评估。利用此方法，研究者鉴定出转录因子DR1可被募集到配体稳定的启动子G4，其去除可解除对代表性富含G4位点的抑制，从而描绘了G4配体活性中蛋白质介导的组成部分。G4L-TACs在现阶段应被视为互补的探针而非治疗替代品。通过将配体结合与急性蛋白质去除联系起来，它们有助于区分蛋白质介导的效应与直接的核酸稳定化效应。本研究结果补充了近期相关研究，表明配体骨架和缀合几何形状可以影响哪些配体共结合蛋白变得可降解，从而揭示了启动子G4结构处的多种调控模式。该研究展示了这种方法在功能发现方面的力量，并提供了一个评估蛋白质对核酸靶向药理学贡献的框架。
4. 实验方法
详细介绍了细胞培养、重组G4抗体（BG4）表达与纯化、泛素化残留蛋白质组学（UbiScan）、基因本体与通路富集分析、重组DR1蛋白纯化、CUT&Tag谱分析、Drug-Seq分析以及相关统计学方法。所有生物实验至少重复三次，数据以平均值±标准误表示，并使用GraphPad Prism进行统计分析和作图。
