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本文揭示，转录因子c-MAF在脓毒症相关性脑病（SAE）中通过直接结合并激活铁输出蛋白编码基因Slc40a1的转录，从而抑制海马神经元铁死亡，改善认知功能。该研究为阐明SAE的分子机制提供了新见解，并提示c-MAF/Slc40a1轴是潜在的治疗靶点。
引言
脓毒症是一种由宿主对感染的反应失衡引起的致命性多器官功能障碍综合征。脓毒症相关性脑病（SAE）是脓毒症常见的严重并发症，发生于约50%的重症监护病房住院患者，部分幸存者在出院后仍经历持久的认知缺陷。其确切分子机制尚不完全清楚。铁死亡是一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式，以线粒体结构改变、铁过载和脂质过氧化失调为特征。溶质载体家族40成员1（SLC40A1）基因编码细胞铁输出蛋白ferroportin（FPN），负责从细胞内区间输出二价铁以维持铁稳态。转录因子c-MAF在神经发育和突触可塑性中发挥关键作用。本研究旨在探究c-MAF是否通过抑制铁死亡来对抗SAE，并阐明c-MAF与Slc40a1之间的调控关系。
材料与方法
使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，通过盲肠结扎穿孔（CLP）手术建立SAE模型。通过立体定位注射重组腺相关病毒9（AAV9），在神经元特异性钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）启动子控制下，对海马神经元进行Slc40a1和c-Maf的基因敲低或过表达。通过转录组测序（RNA-seq）筛选差异表达基因。通过新物体识别（NOR）测试和莫里斯水迷宫（MWM）测试评估小鼠的认知功能。采用尼氏染色观察神经元存活情况。通过蛋白质印迹、实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、免疫荧光等方法检测相关蛋白和基因表达水平。测量活性氧（ROS）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和铁的水平，并使用BODIPY 581/591 C11染色、FerroOrange探针分别检测脂质过氧化和亚铁离子水平。通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）实验阐明c-MAF转录激活Slc40a1的机制。
结果
Slc40a1在脓毒症小鼠海马中表达下调
转录组分析发现，CLP处理后小鼠海马中有331个差异表达基因，其中Slc40a1表达下调。RT-qPCR和蛋白质印迹证实，CLP处理后小鼠海马中Slc40a1 mRNA和FPN蛋白水平均降低。免疫荧光染色显示，FPN主要与神经元标记物NEUN共定位，在CLP后海马神经元的免疫反应性降低。
Slc40a1敲低加剧脓毒症诱导的认知障碍、氧化应激和铁死亡
神经元特异性敲低Slc40a1加重了CLP诱导的急性死亡率、认知功能损伤（表现为NOR识别指数降低，MWM逃避潜伏期延长，目标象限停留时间和平台穿越次数减少）以及海马CA1区尼氏阳性神经元丢失。同时，Slc40a1敲低进一步加剧了海马中ROS、脂质ROS、4-HNE、MDA和铁的积累，并降低了GSH、SOD以及抗铁死亡关键蛋白GPX4的水平。
Slc40a1过表达改善脓毒症诱导的认知障碍、氧化应激和铁死亡
相反，神经元特异性过表达Slc40a1改善了CLP诱导的急性死亡率和认知功能损伤，增加了尼氏阳性神经元数量。此外，Slc40a1过表达抑制了海马中ROS、脂质ROS、4-HNE、MDA和铁的水平，并提升了GSH、SOD和GPX4的表达。
c-MAF是Slc40a1的转录因子
生物信息学分析及实验验证发现，c-MAF是调控Slc40a1的候选转录因子。CLP处理后，小鼠海马中c-MAF表达下调。双荧光素酶报告基因实验表明，c-MAF过表达能显著增强Slc40a1启动子的活性。启动子截短实验确定c-MAF作用于Slc40a1启动子区域-1300 bp至-601 bp。ChIP-qPCR实验证实c-MAF抗体可特异性富集包含Slc40a1启动子区域的DNA片段，表明c-MAF直接结合Slc40a1启动子。
c-Maf敲低加剧脓毒症诱导的认知障碍、氧化应激和铁死亡
神经元特异性敲低c-Maf加重了CLP诱导的急性死亡率、认知功能损伤和神经元丢失。同时，c-Maf敲低进一步下调了Slc40a1/FPN和GPX4的表达，上调了铁调素（Hepcidin）和转铁蛋白受体1（TFR1），下调了铁蛋白重链1（FTH1）。此外，c-Maf敲低加剧了氧化应激和铁死亡相关指标的变化。
c-Maf过表达改善脓毒症诱导的认知障碍、氧化应激和铁死亡
神经元特异性过表达c-Maf改善了CLP诱导的急性死亡率、认知功能损伤和神经元存活。c-Maf过表达上调了Slc40a1/FPN和GPX4，下调了Hepcidin和TFR1，上调了FTH1。同时，c-Maf过表达有效缓解了氧化应激和铁死亡。
Slc40a1敲低消除了c-Maf在SAE中的神经保护作用
在CLP模型中，同时过表达c-Maf并敲低Slc40a1，与单独过表达c-Maf相比，小鼠的存活率、认知功能、神经元存活率均变差，抗氧化和抗铁死亡能力被削弱。这表明Slc40a1是c-Maf发挥神经保护作用的下游关键效应分子。
讨论
本研究将铁死亡的过度激活与SAE中c-MAF和Slc40a1水平降低联系起来。神经元特异性过表达c-Maf和Slc40a1减轻了CLP引发的记忆障碍，并提供了强大的抗氧化和抗铁死亡能力。神经元特异性敲低Slc40a1逆转了c-Maf在SAE进程中的神经保护作用。机制上，c-MAF识别小鼠Slc40a1基因转录起始位点（TSS）上游-1300 bp至-601 bp的序列并促进其转录。研究存在一些局限性，例如AAV干预是预防性的而非治疗性的，且未完全排除非神经元细胞中的脱靶表达。然而，本研究表明抑制铁死亡是预防SAE的一种有前景的策略，c-MAF介导的Slc40a1上调降低了海马对铁死亡的敏感性，突出了c-MAF作为SAE潜在预防靶点的前景。
