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本研究探讨3,4-二氢香豆素（3,4-DHC）对宫颈癌细胞DNA结合及促凋亡机制。通过MTT、TUNEL、γH2A.X染色及光谱和分子对接分析，发现3,4-DHC剂量依赖性诱导DNA损伤和凋亡，其与DNA的混合结合模式（部分插入和沟结合）是主要机制，且具有抗氧化特性，减少非靶细胞损伤。
Megha Radhakrishnan|Bishnu Prasad Parida|Tuliam Khoiyang|Suraj Thapliyal|Mumtaz Ahmad Ansari|S. Krishnamoorthi|Sunita Singh|Gopeshwar Narayan
印度巴纳拉斯印度教大学分子与人类遗传学系
摘要
DNA损伤诱导的细胞周期停滞和凋亡是抗癌治疗中公认的机制。本研究探讨了3,4-二氢香豆素在宫颈癌中的DNA结合特性和凋亡潜力。3,4-二氢香豆素在SiHa、HeLa和HEK293T细胞中引起剂量依赖性的DNA损伤和凋亡，表现为亚G1细胞比例增加、DNA梯形结构、TUNEL阳性以及γH2A.X焦点。显著的ROS清除能力和AIFM/EndoG的非核转位可以消除氧化或线粒体介导的DNA损伤。对接研究和生物物理分析（1H-NMR、CD光谱和紫外吸收）显示其具有混合结合模式，表明其对基因组完整性和细胞复制有干扰作用。因此，3,4-二氢香豆素与DNA的直接相互作用可以被认为是导致处理细胞出现细胞毒性和凋亡的主要分子机制。我们的研究表明，3,4-二氢香豆素在体外能诱导DNA损伤并表现出显著的ROS清除能力，从而具有抗增殖效果。
引言
宫颈癌仍然是全球主要的健康负担，主要源于持续的高风险HPV感染，这种感染会促进基因组不稳定性和DNA损伤反应途径的失调。癌细胞的一个显著特征是它们能够逃避正常的调控机制和维持基因组完整性的细胞周期检查点。这些恶性细胞的特性使它们能够通过端粒酶重新激活和逃避凋亡来无限复制[1]。因此，由于DNA在维持基因组完整性和调节细胞动态及增殖中的关键作用，针对DNA可以作为癌症治疗的通用方法。由于癌细胞的复制压力增加、基因组不稳定性和DNA修复机制受损，它们比正常健康细胞更容易受到DNA损伤剂的影响[2,3]。因此，DNA可以作为不同肿瘤类型的通用分子靶点，适用于单药治疗和联合治疗。许多针对DNA的抗癌药物（包括顺铂）存在一些缺点，如仅适用于特定类型的癌症、药物耐药性和由于ROS生成而产生的严重副作用[4]。因此，开发新的针对DNA的治疗药物是必要的，以克服现有疗法的局限性。此外，具有ROS清除能力的DNA靶向药物在联合治疗中使用时将更加有益，因为它们可以显著提高药物疗效。
DNA结合剂通常通过已知的机制进行相互作用，包括碱基对之间的插入、沟槽结合（主要或次要沟槽）或与磷酸骨架的外部静电结合。结合模式对生物学结果（如DNA损伤、复制压力和DNA损伤反应信号的激活）有重要影响。
本研究探讨了3,4-二氢香豆素（3,4-DHC；SMILES: C1CC(=O)OC2=CC=CC=C21）的细胞毒性和DNA相互作用潜力。3,4-二氢香豆素是一种天然存在的非姜黄素类香豆素衍生物，存在于多种植物物种中，如Curcuma caesia，并常用于香料和调味品行业。结构上，3,4-DHC由一个苯环与内酯结构融合而成，赋予其平面性和芳香性，这可能有助于其与生物大分子的相互作用。香豆素衍生物已被广泛报道具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗菌和抗增殖作用。Curcuma caesia提取物的LC-HRMS分析表明3,4-二氢香豆素是其主要成分之一。3,4-二氢香豆素在宫颈癌细胞系中表现出显著的细胞毒性，诱导广泛的凋亡，ADME分析显示其具有高胃肠道吸收率、低肝毒性和良好的药物特性[5]。先前的研究表明，3,4-二氢香豆素可作为组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的抑制剂，其抑制HDACs会导致p53过度乙酰化，从而增加凋亡[6]。酵母研究显示，3,4-二氢香豆素可增强细胞对DNA损伤的敏感性，导致凋亡和自噬[7]。
3,4-二氢香豆素的细胞毒性机制尚不完全清楚。虽然某些香豆素已被报道可以直接或间接与DNA相互作用，但3,4-二氢香豆素本身的DNA结合潜力尚未得到充分研究。DNA结合小分子通常包含芳香或杂环结构，并带有能够与DNA螺旋形成氢键或静电相互作用的官能团。作为一个小芳香分子，3,4-二氢香豆素可能与DNA共价或非共价结合，这是一个值得探索的领域。在本研究中，通过多种体外实验评估了3,4-二氢香豆素在宫颈癌SiHa和HeLa细胞中的细胞毒性和ROS清除潜力。HPV阳性的宫颈癌细胞系（包括SiHa和HeLa）因其遗传背景明确、HPV拷贝数不同以及对DNA损伤和氧化应激的反应不同而被广泛用作实验模型。这些细胞模型有助于评估干扰DNA结构、诱导基因组压力并激活下游凋亡或衰老相关途径的化合物的作用机制。圆二色性、NMR和吸收光谱是研究DNA药物相互作用的经典工具。这些技术被用来通过圆二色性监测DNA二级结构的变化、通过NMR观察局部原子环境的变化以及通过吸收光谱确定DNA结合模式或结合位点。我们的结果表明，3,4-二氢香豆素具有强烈的DNA结合亲和力，在宫颈癌细胞中引起显著的DNA损伤，导致显著的凋亡和细胞衰老。这些发现揭示了3,4-二氢香豆素的DNA损伤效果，并强调了其作为抗增殖剂的潜力。
实验部分
细胞培养
人类宫颈癌细胞系SiHa（CVCL_0032，购买于2024年3月18日）和HeLa（CVCL_0030，购买于2024年11月12日），以及人类胚胎肾细胞HEK293T（CVCL_0063，购买于2024年3月18日），均来自印度浦那的国家细胞科学中心（NCCS）。培养在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco，美国）和1%抗生素-抗真菌溶液（Gibco，美国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，美国）中，在37°C的湿润环境中进行
3,4-二氢香豆素对SiHa、HeLa和HEK293T细胞具有显著的细胞毒性
使用MTT实验评估了3,4-二氢香豆素对SiHa、HeLa和HEK293T细胞的细胞毒性。如图1a所示，3,4-二氢香豆素（0.75-3mM）处理48小时和72小时后，对SiHa、HeLa和HEK293T细胞产生了剂量和时间依赖性的细胞毒性效应。结果表明，在较高浓度的3,4-二氢香豆素下，存活细胞数量显著减少，尤其是在0.75mM及以上剂量时效果明显。
讨论
诱导DNA损伤并触发细胞周期停滞和凋亡是癌症治疗中公认的抗癌机制[11]。与正常细胞相比，癌细胞的复制速率更高，修复机制受损，细胞周期检查点失调，因此对DNA靶向剂更敏感[12]。一些天然化合物（如辣椒素、放线菌素D和pierisin）已被报道具有DNA结合能力
结论
3,4-二氢香豆素通过分子水平靶向DNA，在宫颈癌细胞中表现出显著的细胞毒性和凋亡效应。已建立的化疗策略主要涉及ROS介导的DNA损伤和线粒体因子（如AIFM/EndoG）的激活，这通常会导致非恶性细胞的氧化应激和损伤。生物物理和分子对接研究证实了其具有混合DNA结合模式，包括部分插入和沟槽结合
CRediT作者贡献声明
Megha Radhakrishnan：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析。Bishnu Prasad Parida：验证、软件、方法学。Tuliam Khoiyang：可视化、验证。Suraj Thapliyal：可视化、软件。Mumtaz Ahmad Ansari：监督、方法学。S. Krishnamoorthi：可视化、软件。Sunita Singh：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。Gopeshwar Narayan：撰写——审阅与编辑、监督、资源、项目
致谢
作者感谢印度医学研究委员会（ICMR）的财政支持，资助编号为
