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β-葡萄糖苷酶抑制剂研究：新合成的异吲哚羧酰胺衍生物通过体外酶活性测试、分子对接和细胞毒性评估，发现化合物5（IC50=7.1 μM）和9（IC50=8.0 μM）具有高抑制活性，优于EGCG，且安全性优于阿霉素。
Munirah M. Al-Rooqi|Mohamed Sharaf|Abdulaziz M. Almohyawi|Abdulrahman A. Alsimaree|Amr H. Moustafa|Saeed S. Samman|Mounir A.A. Mohamed|Amany M. Hamed|Ziad Moussa|Omran A. Omran|Saleh A. Ahmed
沙特阿拉伯乌姆阿尔-库拉大学理学院化学系，21955，麦加
摘要
β-葡萄糖醛酸酶（β-GUS）参与外源性物质的再活化、炎症反应以及药物引起的毒性作用，因此成为重要的治疗靶点。在本研究中，通过体外酶测定、分子对接和细胞毒性分析评估了新合成的异香豆素-羧亚胺酰胺衍生物作为β-GUS抑制剂的效果。所有化合物均在1.56–100 μM的浓度下进行筛选，并将其IC??值与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）进行比较。化合物5表现出最强的抑制作用，在100 μM浓度下抑制率为99.9%，其IC??值最低（7.1 μM），优于EGCG（IC?? = 8.0 μM）。化合物9的活性与EGCG相当（IC?? = 8.0 μM），而其他衍生物的抑制作用较弱（IC?? = 102–300 μM）。分子对接结果支持实验发现，表明化合物5和9能与β-GUS活性位点的关键残基（His127和Ile172）发生有利相互作用，结合能分别为-3.38和-3.70 kcal/mol。在HepG2和MCF-7细胞系中的细胞毒性评估显示，化合物5和9的毒性显著低于多柔比星。值得注意的是，这是首次报道异香豆素-羧亚胺酰胺衍生物作为β-GUS抑制剂的研究，且具有良好的安全性特征。总体而言，这些发现表明化合物5和9是具有潜力的β-GUS抑制剂候选分子，其中化合物5的抑制效果最强，为进一步药理学研究提供了基础。
引言
β-葡萄糖醛酸酶是哺乳动物体内广泛存在的一种酶，在通过水解内源性和外源性化合物的葡萄糖醛酸酯形式实现解毒过程中起着关键作用[1,2]。然而，β-葡萄糖醛酸酶活性的异常升高与多种病理状态相关，包括癌症、炎症、感染和代谢紊乱。酶活性的增强会通过重新激活有毒和致癌物质促进癌症进展，并可能增加对化疗的耐药性[3,4]。在炎症情况下，β-葡萄糖醛酸酶水平的升高会通过释放有害代谢物进一步加剧组织损伤。因此，寻找高效的β-葡萄糖醛酸酶抑制剂成为治疗多种疾病的有希望策略。β-葡萄糖醛酸酶能够分解正常组织和癌组织细胞外基质中的复杂糖缀合物。例如，在结直肠癌细胞中观察到的β-葡萄糖醛酸酶水平高于非癌组织[5], [6], [7]。在癌症生物学中，该酶的催化作用会促进细胞外基质的降解，进而通过释放生物活性苷元和改变肿瘤微环境来支持肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[3,8,9]。临床上，β-葡萄糖醛酸酶与多种恶性肿瘤相关：在肝癌、结肠癌、膀胱肿瘤和激素依赖性癌症中均发现其活性增强[10,11]。β-葡萄糖醛酸酶水平的升高还可用作肿瘤的诊断或预后标志物，有助于实时监测、早期发现和治疗管理[12]。除了肿瘤学领域，高β-葡萄糖醛酸酶活性还与其他病理生理状态相关，如癫痫、肝损伤和代谢-溶酶体疾病：例如，人类GUS基因的缺陷会导致黏多糖贮积症VII型（Sly综合征），其特征是大脑和其他器官中糖胺聚糖的积累[10]。从治疗角度来看，针对β-葡萄糖醛酸酶（尤其是微生物或组织相关异构体）具有潜力：通过抑制该酶对类固醇激素、外源性物质和致癌物的去葡萄糖醛酸化作用，可以减少局部毒性或增殖暴露，降低药物/代谢物的肠肝循环，并调节肿瘤微环境动态[13,14]。然而，现有的小分子抑制剂仍较为有限，许多抑制剂缺乏选择性（针对人类与微生物）、肠道定位性或明确的结构-活性关系（SAR）。基于异香豆素的独特电子特性，功能化的异香豆素衍生物成为多种生物活性类似物的核心，能够稳定占据酶的活性位点[15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]。在异香豆素核心上引入羧亚胺酰胺基团（-C(=NH)NH?）可增强氢键的供受能力、极性相互作用以及可调的立体/亲脂性[22], [23], [24]。尽管异香豆素衍生物的研究较为广泛，但其在β-葡萄糖醛酸酶抑制剂方面的应用仍存在不足。因此，我们设计了一系列新的异香豆素-羧亚胺酰胺衍生物，并通过体外酶测定、分子对接和细胞毒性分析评估了它们的抑制潜力。化学部分
起始物质4-((2-氧代吲哚-3-亚基)氨基)苯甲酸（1）和4-((1-甲基-2-氧代吲哚-3-亚基)氨基)苯甲酸（2）是根据已发表的方法[25]，分别通过异香豆素和/或N-甲基异香豆素与对氨基苯甲酸在乙酸溶剂中的反应制备的（方案1）。
苯甲酸衍生物（1-2）在偶联剂N,N'-羰基二咪唑（CDI）的存在下，与芳基氨基肟（3）在乙腈中室温下反应。
化学试剂与材料
底物p-硝基苯基-β-葡萄糖醛酸（PNPG）和参考抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。β-葡萄糖醛酸酶（E.C. 3.2.1.31，来自牛肝，G-0251）也从Sigma-Aldrich购买。所有溶剂和试剂均为分析级。底物（PNPG）的100 mM储备液新鲜配制在DMSO中，并在-20°C下保存直至使用。所有缓冲液均按标准方法配制。4-((2-氧代吲哚-3-亚基)氨基)苯甲酸（1）和/或4-((1-甲基-2-氧代吲哚-3-亚基)苯甲酸（2）的合成
等摩尔的异香豆素和/或N-甲基异香豆素（0.01 mol）与对氨基苯甲酸（0.01 mol，1.37 g）在乙酸（20 mL）中回流约8小时。反应进程通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物蒸发，倒入水中搅拌，过滤收集沉淀物，用蒸馏水洗涤，干燥后从乙醇中重结晶。4-((2-氧代吲哚-3-亚基)氨基)苯甲酸（1）和/或4-((1-甲基-2-氧代吲哚-3-亚基)苯甲酸（2）的合成通用方法
在本研究中，合成的异香豆素-羧亚胺酰胺衍生物（化合物5和化合物9）通过计算模拟、体外β-葡萄糖醛酸酶抑制实验和细胞毒性评估显示出了良好的生物活性。分子对接结果显示，这两种化合物能够稳定结合到β-葡萄糖醛酸酶的活性位点（PDB: 1BHG），并与His127和Ile172残基形成关键相互作用，尽管结合亲和力低于标准抑制剂。
缩写说明
β-GUS：β-葡萄糖醛酸酶
C2 / C6：化合物2 / 化合物6
DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基
DMSO：二甲基亚砜
EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯
FBS：胎牛血清
H-bond：氢键
HepG2：人肝细胞癌细胞系
IC??：半数抑制浓度
MCF-7：人乳腺腺癌细胞系
PNP：对硝基苯酚
PNPG：对硝基苯基-β-葡萄糖醛酸
RMSD：均方根偏差
作者贡献声明
Munirah M. Al-Rooqi：研究设计、方法学研究、数据管理、资金获取；Mohamed Sharaf：方法学研究、数据管理、初稿撰写；Abdulaziz M. Almohyawi：资源提供、数据管理、软件使用、资金获取；Abdulrahman A. Alsimaree：方法学研究、研究设计、资金获取、资源提供、初稿撰写；Amr H. Moustafa：Saeed S. Samman：研究设计……
资金支持声明
本研究由沙特阿拉伯乌姆阿尔-库拉大学资助，资助编号为：26UQU4320545GSSR05。
数据可用性声明
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。
出版同意声明
本文为原创作品，作者此前未在任何期刊上发表过，提交时也未被其他期刊考虑。
CRediT作者贡献声明
Munirah M. Al-Rooqi：方法学研究、资金获取、数据管理、研究设计；Mohamed Sharaf：初稿撰写、方法学研究、数据管理、研究设计；Abdulaziz M. Almohyawi：软件使用、资源提供、资金获取、数据管理；Abdulrahman A. Alsimaree：初稿撰写、方法学研究、资金获取、数据管理；Amr H. Moustafa：监督工作、软件使用、数据分析……
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢沙特阿拉伯乌姆阿尔-库拉大学通过资助编号26UQU4320545GSSR05对本研究的支持。
