《Aging Cell》：Altered Cytokine-Induced STAT3 and STAT5 Activation of Peripheral T Follicular Helper Cells Contributes to Vaccine-Non-Responsiveness in Aging and HIV
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本文研究揭示，在老龄化和HIV感染者中，外周滤泡辅助性T细胞（pTfh）的细胞因子信号传导失调是其对流感疫苗反应减弱的关键机制。研究发现，随着年龄增长，pTfh细胞的白细胞介素-2（IL-2）诱导的信号转导和转录激活因子5（STAT5）信号增强，而IL-21诱导的STAT3信号减弱。这种STAT3/STAT5信号轴失衡，尤其在疫苗无应答者中与抗体滴度负相关，表明其损害了Tfh细胞的分化和B细胞辅助功能，最终导致疫苗保护效力下降。该研究为理解免疫衰老和慢性感染背景下的体液免疫缺陷提供了新见解。
引言
随着抗逆转录病毒疗法的成功，HIV感染者的预期寿命已与未感染者相近。然而，HIV感染者仍持续经历慢性免疫激活和炎症，导致与非艾滋病相关的、与免疫衰老相关的共病风险更高、发病更早。老年人是流感等疫苗可预防疾病重症并发症的高危人群。此前研究已发现，在老龄化和HIV感染背景下，针对流感疫苗的血清学反应不佳。滤泡辅助性T细胞是辅助性CD4+T细胞的一个亚群，在通过支持生发中心B细胞来调节体液免疫方面发挥着至关重要的作用。离开淋巴结后，Tfh细胞可以作为外周Tfh细胞进入循环。Tfh细胞的维持和从初始CD4+T细胞分化，受到细胞因子-STAT信号通路影响的转录因子网络的调控。IL-21通过STAT3发挥作用，而IL-2诱导的STAT5则对Tfh分化具有拮抗作用。我们之前的研究发现，疫苗无应答者的抗原特异性pTfh细胞存在表型和功能差异，其特征是IL-21生成减少、IL-2生成增加，并表现出促炎表型。基于pTfh细胞功能在疫苗诱导抗体反应中的关键作用，我们假设年龄和HIV状况会影响pTfh细胞中细胞因子诱导的STAT5和STAT3信号通路，从而可能降低疫苗反应。
研究队列描述与疫苗应答者分类验证
本研究共纳入90名参与者，包括52名疫苗应答者和38名疫苗无应答者。平均年龄在VR和VNR组之间相似。平均流感疫苗评分（对疫苗抗原免疫反应的累积测量）在VR组为8，在VNR组为2。绝对CD4+T细胞计数在年龄组间无差异，而年轻和年老的HIV感染者的CD4/CD8比率显著低于同年龄匹配的未感染者。血清血凝抑制抗体滴度在基线（第0天；接种前）以及接种后第7、14、28和180天进行测量。在VR参与者中，老年人显示出较低的A/H1N1和全疫苗反应趋势。此外，在VR参与者中，与未感染者相比，HIV感染者的A/H1N1反应显著降低。在VNR参与者中，针对全疫苗、A/H1N1、A/H3N2和B/Yamagata抗原的血凝抑制抗体滴度与实足年龄呈一致的负相关，表明年龄相关的免疫功能障碍在易出现疫苗反应不佳的个体中可能被放大。
外周Tfh细胞频率与疫苗反应性相关
接下来，我们比较了各研究组中pTfh细胞的频率，并研究了它们与血清学疫苗反应的关系。总体而言，pTfh频率在年龄组、HIV状况或疫苗反应状态方面没有差异，而年轻未感染者与其他参与者组相比，pTfh细胞频率有较高的趋势。在年轻个体中，pTfh频率与疫苗评分和全疫苗血凝抑制抗体滴度变化呈正相关，而在老年个体中未发现这种关联。这些发现与我们课题组先前的研究一致，表明接种前Tfh细胞频率较高与年轻未感染者疫苗诱导的抗体反应增强相关。
增龄伴或不伴HIV感染时IL-2诱导的STAT5增加和IL-21诱导的STAT3减少
基于我们之前观察到的体外抗原刺激后pTfh细胞IL-21生成减少和IL-2生成增加与流感疫苗反应不佳相关，我们假设pTfh细胞中差异性的IL-21诱导的STAT3和IL-2诱导的STAT5活化有助于导致老龄化和HIV感染背景下的疫苗反应受损。我们观察到年轻个体和VR的pTfh细胞中IL-21诱导的STAT3活化显著高于老年个体和VNR。在所有参与者中，pTfh细胞的IL-21诱导的STAT3活化与实际年龄负相关。出乎意料的是，HIV感染者的pTfh IL-21诱导的STAT3反应高于未感染者，这主要是由于年轻HIV感染者的反应升高所致。相比之下，无论疫苗反应状态如何，老年参与者pTfh细胞的IL-2诱导的STAT5活化更高。在所有研究参与者中，pTfh细胞的IL-2诱导的STAT5与实际年龄呈正相关，而pTfh IL-2诱导的STAT5活化在HIV状况方面未观察到显著差异。当按年龄和HIV亚组分开时，年轻未感染者和年轻HIV感染者显示出比老年未感染者更低的IL-2诱导的STAT5活化。
使用独立的流式细胞术 panel，我们评估了来自相同参与者的pTfh细胞中IL-21受体和高亲和力IL-2受体的表达。与年轻参与者相比，老年人表达IL-2Rα的pTfh细胞频率显著更高。在所有参与者中，表达IL-2Rα的pTfh细胞频率与pTfh IL-2诱导的STAT5活化和实际年龄均呈正相关。按年龄组分层的分析显示，仅在老年参与者中，IL-2诱导的STAT5活化与表达IL-2Rα的pTfh细胞频率呈正相关，而在年轻参与者中未观察到这种关系。表达IL-2Rα的pTfh细胞频率在疫苗反应或HIV状况方面未发现显著差异。对年龄-HIV合并亚组的分析显示，在年轻或老年组内，基于HIV状态没有差异，而年龄差异主要是由老年未感染者与年轻未感染者相比IL-2Rα增加所驱动。
接下来，我们研究了IL-2诱导的STAT3和IL-21诱导的STAT5活化在疫苗反应中的作用，因为两种细胞因子都可以在一定程度上交叉活化STAT3和STAT5，具体取决于受体表达和细胞环境。与年轻参与者相比，老年参与者的总CD4+T和pTfh细胞中IL-2诱导的STAT3活化水平更高。年轻VNR参与者的pTfh和总CD4+T细胞中IL-2诱导的STAT3水平低于老年VR和VNR参与者。相比之下，无论疫苗反应状态如何，老年参与者，特别是老年VNR，在总CD4+和pTfh细胞区室中IL-21诱导的STAT5水平更高。HIV状况与IL-21诱导的STAT3或IL-21诱导的STAT5水平的差异无关。对所有研究参与者的相关性分析显示，pTfh细胞中IL-21诱导和IL-2诱导的STAT3活化之间、IL-2诱导和IL-21诱导的STAT5活化之间以及IL-2诱导的STAT5和STAT3活化之间存在正相关。值得注意的是，pTfh细胞中IL-2诱导的STAT5和STAT3活化之间的相关性仅在老年参与者中观察到。相反，pTfh细胞中IL-21诱导和IL-2诱导的STAT3活化之间的相关性在年轻参与者中更强。总之，这些发现表明，老龄化（而非HIV状况）改变了pTfh细胞亚群中细胞因子驱动的STAT信号传导，可能有助于导致适应性免疫反应受损。老年参与者中IL-2诱导的STAT3活化增加，可能代表了对老龄化导致的IL-21介导的STAT3信号传导减弱的一种补偿机制。
最后，鉴于pTfh细胞频率与疫苗反应性之间已确立的与老龄化相关的变化关系，我们研究了pTfh频率与细胞因子诱导的STAT活化之间的关联。我们的研究结果显示，在老年个体和HIV感染者中，pTfh频率与IL-2诱导的STAT5与IL-2诱导的STAT3的比值呈正相关。在被归类为VNR的HIV感染者中，pTfh细胞中的IL-2诱导STAT5活化与pTfh频率呈强正相关，而这种关系在VR中未观察到。
为了评估细胞因子诱导的STAT活化与适应性免疫之间潜在的功能关系，我们将STAT活化与对流感疫苗的血清学反应相关联。在VNR中（而非VR中），pTfh细胞中的IL-2诱导STAT5活化与第14天和第28天的全疫苗血凝抑制抗体滴度呈负相关。在VNR中，IL-2诱导的STAT5与第28天全疫苗血凝抑制抗体滴度之间的负相关仅在未感染者中观察到。
初始CD4+T细胞支持年轻参与者的pTfh IL-21诱导STAT3活化
在所有参与者中，pTfh细胞中的IL-21诱导STAT3活化与初始CD4+T细胞区室中的IL-21诱导STAT3直接相关。此外，仅在年轻参与者中，初始CD4+T细胞中的IL-21诱导STAT3与记忆CD4+T细胞区室内的pTfh细胞频率呈正相关。这些发现表明，初始CD4+T细胞中的IL-21诱导STAT3活化可能促进年轻个体中pTfh细胞分化以增强抗原反应，而与年龄相关的细胞内在免疫改变似乎在老年参与者中限制了这种效应，这种关联随着年龄增长而减弱。
讨论
老年人和HIV感染者面临流感相关疾病重症的更高风险，而作为主要预防策略的流感疫苗在这些个体中引发的抗体反应较弱。广泛的研究已记录了与年龄相关的疫苗反应性损伤，这在HIV感染者中进一步加剧。我们之前曾报告病毒抑制的HIV感染者的免疫功能障碍，其特征是与年龄匹配的未感染者相比，免疫衰老、免疫激活和耗竭增加，这与流感疫苗反应减弱相关。尽管高剂量或佐剂流感疫苗等策略可以部分减轻与年龄相关的疫苗有效性下降，但它们并未解决与老龄化和慢性HIV感染相关的潜在细胞内在免疫缺陷。
外周Tfh细胞在协调体液免疫反应中起着核心作用，我们课题组先前的研究已确定了pTfh频率、功能与疫苗反应性之间的强关联。值得注意的是，缺乏IL-21生成的pTfh细胞，连同抗原刺激后IL-2和肿瘤坏死因子生成增加，以及向炎症性Tfh1/Tfh17表型的转变，导致了疫苗无应答。从机制上讲，最佳的Tfh分化和功能依赖于IL-21-STAT3信号轴，该轴驱动Bcl6表达并维持Tfh转录程序。相反，IL-2诱导的STAT5信号传导通过上调Blimp-1表达来拮抗Tfh命运，从而促进Th1分化。基于我们之前发现的pTfh细胞中改变的IL-21和IL-2反应与血清学疫苗反应受损之间的关联，我们设计了本研究，以研究pTfh细胞中与年龄和HIV相关的细胞内在IL-2诱导和IL-21诱导的STAT3和STAT5活化的改变是否有助于导致对疫苗接种的次优免疫反应。
与我们之前的研究一致，我们观察到实足年龄与疫苗反应之间呈负相关，尤其是在VNR中。这些发现表明，与年龄相关的免疫缺陷可能降低整体疫苗效力，并使某些个体易出现疫苗反应不佳，从而放大老龄化对该队列体液免疫结果的影响。支持这一观察结果的是，在被归类为VNR的参与者中，pTfh细胞中的IL-2诱导STAT5活化与全疫苗血凝抑制抗体滴度呈负相关。值得注意的是，尽管各年龄、HIV状况和疫苗反应状态之间的pTfh频率相当，但老年人仍表现出pTfh细胞中IL-2诱导的STAT5活化增加，这表明细胞内在功能缺陷而非pTfh细胞的定量缺陷损害了Tfh介导的B细胞辅助。此外，老年参与者表现出更高频率的表达IL-2Rα的pTfh细胞，这与IL-2诱导的STAT5活性增加相关。这些发现表明，pTfh细胞中与年龄相关的IL-2反应性和STAT5活性增加，可能损害其功能能力。在解释这些结果时，区分细胞因子信号敏感性和最大信号传导能力非常重要。本研究中使用的超生理浓度的IL-2和IL-21（50 ng/mL）使我们能够评估pTfh细胞的内在STAT信号传导能力，而不是由生理性细胞因子可用性或受体接合驱动的差异。与我们研究结果一致的是，先前的研究表明，老年人的初始CD4+T细胞在染色质区域内表现出STAT5结合基序的富集，这些区域具有年龄加速的可及性，T细胞受体刺激后IL-2Rα转录和蛋白表达增加，磷酸化STAT5和STAT5调节的转录因子升高。
慢性免疫激活和炎症衰老是老龄化和慢性HIV感染的标志，可能驱动持续的IL-2诱导STAT5活性。反复的抗原和炎症刺激维持了高水平的CD25表达，强化了IL-2:IL-2Rα信号传导正反馈环，并延长了STAT5活化。这种STAT5主导的信号传导环境可能抑制有效Tfh辅助功能所需的IL-21/STAT3程序。研究表明，来自长期病毒抑制的HIV感染者的Tfh细胞由于IL-2富集的微环境而功能失调，其特征是IL-21生成减少、CXCR5和Bcl6表达降低，同时IL-2驱动的干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α分泌增加。病毒抑制的HIV感染者也表现出更高频率的表达IL-2Rα的Tfh细胞，这与Tfh细胞频率和体外总免疫球蛋白G生成呈负相关。值得注意的是，在精英控制者的共培养物中添加外源性IL-2重现了这种功能失调表型，导致B细胞反应受损和促炎Tfh程序增强。与这种IL-2主导、STAT5偏向的Tfh功能障碍模型一致，我们之前的研究表明，用流感抗原刺激并用外源性IL-21结合IL-2和肿瘤坏死因子中和处理的pTfh/B细胞/抗原呈递细胞共培养物，在VNR参与者中表现出增强的免疫球蛋白G生成，与HIV状态无关。
通常在激活事件之间下调IL-2受体表达的负调节机制，在老龄化和HIV感染中可能不足以有效下调IL-2受体表达。在IL-2接合后，IL-2Rβ和γc被溶酶体降解，而IL-2Rα被运输到早期内体再循环回细胞表面。由FOXO1支持的溶酶体活性在老年人的初始CD4+T细胞中降低，抑制了蛋白质周转。在HIV感染者中，间歇性IL-2疗法已被证明可诱导一个IL-2R阳性初始CD4+T细胞池，该细胞池在治疗停止后可持续存在长达5年。总之，这些发现表明，慢性IL-2暴露可能将Tfh细胞“锁定”在一种适应不良状态，其特征是STAT5信号传导增强、IL-21生成受损和B细胞辅助功能缺陷。IL-2:IL-2R反馈环的调节进一步受到老龄化和HIV感染中加剧的代谢应激源的影响。此外，虽然IL-2是STAT5活化的主要驱动因素，但在老龄化和慢性HIV感染中已知会增加的γc细胞因子（如IL-7或IL-15）可能进一步独立于IL-2维持STAT5信号传导，从而在pTfh细胞中强化STAT5主导的信号传导环境。
与最近的研究一致，老年参与者初始CD4+T细胞中增加的IL-2诱导STAT5，表明信号传导偏向促炎性Th1表型。除了将pTfh STAT5抑制确定为增强老龄化中抗体反应的潜在机制外，我们的研究表明，增强初始CD4+T细胞中的IL-21诱导STAT3活性可能显著影响Tfh分化和功能。在年轻参与者中，初始CD4+T细胞中的IL-21诱导STAT3活化与更高的pTfh细胞频率相关，突显了IL-21-STAT3轴在维持Tfh区室中的重要性。与更强的疫苗反应一致，与老年参与者相比，年轻个体在pTfh细胞中表现出更高的IL-21诱导STAT3和更低的IL-2诱导STAT5活性。总之，这些发现支持一个模型，即年轻个体中IL-21驱动的STAT3信号传导促进初始CD4+T细胞向Tfh谱系分化并维持pTfh区室，而老年个体初始CD4+T细胞中增强的IL-2诱导STAT5信号传导使CD4+T细胞分化偏向炎症性Th1样表型，损害了有效的Tfh反应。
其他因素可能影响STAT磷酸化和疫苗反应性。与老龄化和HIV相关的代谢失调进一步强化了STAT5信号传导动态。静息记忆T细胞主要依赖线粒体氧化磷酸化来维持稳态，并在激活后上调糖酵解和氧化磷酸化以快速产生增殖所需的ATP和中间产物。老龄化与记忆CD4+T细胞中更高的基础氧化磷酸化和最大氧化磷酸化能力、糖酵解减少、线粒体含量增加和活性氧生成升高相关，共同促进了促炎细胞因子生成和炎症衰老。同样，来自病毒抑制的HIV感染者的CD4+T细胞表现出耗竭的线粒体表型，线粒体质量和膜电位增加，以及与促炎细胞因子生成增加和高糖酵解性Th1/Th17生成相关的糖酵解代谢增强。IL-2信号传导激活PI3K-AKT-mTORC1通路，增强线粒体功能和葡萄糖摄取，从而将代谢转向糖酵解，并限制了记忆T细胞和Tfh细胞的生成。先前的研究表明，糖酵解被Bcl6抑制，而IL-2依赖的糖酵解诱导需要Th1特异性转录因子T-bet。老龄化和HIV可能创造了一个ATP丰富的细胞环境，有利于JAK激酶活性，增加STAT5磷酸化，并促进远离Tfh谱系的极化。
总之，我们的数据支持一个模型，其中年龄和HIV相关的慢性免疫激活、炎症和pTfh细胞功能障碍是改变细胞因子敏感性和信号传导平衡的上游因素，导致IL-2反应性增加和IL-21反应性降低。这种失衡促进了持续的STAT5活化，损害了STAT3，强化了IL-2受体表达，抑制了IL-21/STAT3依赖的Tfh辅助程序，损害了有效的B细胞辅助，促进了Th1样极化，增加了促炎细胞因子的产生，并最终导致次优的疫苗结果。我们的研究表明，结合评估IL-2诱导的STAT5信号传导、血清IL-2水平和表达IL-2R的Tfh细胞频率，可能作为Tfh细胞适应性和下游血清学结果的潜在预测生物标志物。需要进一步的研究来调查老龄化和HIV中损害整体免疫能力的STAT信号传导缺陷的潜在机制。此外，未来的研究应确定在疫苗接种时增强IL-21或调节pTfh细胞中的STAT5信号传导等干预措施，是否可以逆转与老龄化相关的表观遗传和转录改变，恢复STAT信号传导平衡，减轻炎症衰老，并增强老年人和HIV感染者的Tfh细胞功能和疫苗反应。
我们的研究有几个局限性。虽然CD4+T细胞计数在老龄化和HIV组间具有可比性，但未感染者的基线CD4+/CD8+T细胞比率高于HIV感染者。这种差异可能表明HIV感染者尽管长期病毒抑制，但仍存在持续的免疫重建缺陷。其他病原体如巨细胞病毒的感染也会影响CD4+/CD8+T细胞比率和老龄化中的流感疫苗反应；然而，我们未发现研究组间巨细胞病毒血清状态存在显著差异。虽然已知细胞因子如转化生长因子-β、IL-12和IL-23在淋巴组织内引导初始CD4+T细胞向Tfh分化和谱系定型，但这些超出了当前研究的范围。我们的分析集中在循环外周Tfh细胞上，这些细胞代表已定型于Tfh谱系的成熟、抗原经验记忆T细胞。此外，每个VR和VNR亚组中的参与者数量有限。尽管如此，在这些限制下，我们在各分析中观察到一致的研究结果。最后，虽然我们建立了多色磷酸化流式细胞术方法来同时评估多个免疫细胞亚群中的STAT磷酸化，但我们无法全面评估额外的Tfh特异性标志物，包括Bcl6、ICOS和PD-1。这一限制主要源于STAT检测所需的严格固定和透化方案，特别是使用高甲醇浓度，这可能会损害荧光染料的稳定性和抗体表位的完整性。
结论
总之，我们的研究结果表明，细胞因子微环境和免疫反应部位的早期细胞因子诱导STAT信号传导，对CD4+辅助性T细胞向Tfh谱系分化起着至关重要的塑造作用，这些过程是与年龄相关免疫功能障碍的核心。这些数据支持了STAT3/STAT5信号轴失调在与老龄化相关的疫苗无应答中起关键作用的假设。需要进一步的研究来阐明Tfh相关的STAT3和STAT5信号通路如何导致老龄化和老年HIV感染者免疫力受损的机制。
