基于化学计量学和机器学习的无标记拉曼微光谱细胞成像技术以及对苹果枝溃疡病进展的的非靶向UPLC-HRMS代谢组学研究

苹果枝干溃疡病由Botryosphaeria dothidea引起，本研究通过共聚焦拉曼显微成像结合化学计量学，系统解析了表皮和皮层中脂类、木质素等防御成分的时空动态变化，并利用UPLC-Q-Orbitrap-MS代谢组学与机器学习发现2090种差异代谢物，揭示关键代谢通路（如异喹啉生物碱合成），构建了拉曼光谱与机器学习联用的早期诊断平台（准确率97.2%），为植物病害研究提供新方法。

　　

作者：姜英芳、李梅、刘海莎、蒋金光、陈东梅、严秀芳、康超、刘雅娟

中国贵州大学化学与化学工程学院大环与超分子化学重点实验室，贵阳 550025

摘要

由Botryosphaeria dothidea引起的苹果枝溃疡病对全球苹果生产构成了严重威胁。尽管该病具有重要的经济意义，但目前对感染动态和宿主防御反应的理解和分析技术仍然有限。本文开发了一种基于共聚焦拉曼显微光谱成像与化学计量学的原位、无标记、高通量、精确的成像方法，用于表征角质层和细胞壁中的关键防御成分（包括脂质、木质素、酚类、纤维素、半纤维素和果胶），并监测它们在表皮和皮层中的时空动态。在感染过程中，表皮角质层中的木质素最初减少，而脂质和酚类增加；皮层中的细胞壁防御成分先减少，3天后再次增加；所有这些成分在5天后均减少，从而导致疾病症状。此外，通过使用UPLC–Q–Orbitrap–MS进行非靶向代谢组学分析并结合机器学习，筛选出2090种差异代谢物（包括苯丙素类和聚酮类、有机杂环化合物、脂质及类脂分子），并发现与防御激活相关的显著富集代谢途径（例如异喹啉生物碱生物合成、黄酮类生物合成）。此外，一种结合拉曼光谱与机器学习的快速、非破坏性诊断平台实现了苹果枝溃疡病的早期检测，总体准确率为97.2%。总体而言，这种多技术整合策略为果树病原性和防御反应提供了新的见解，并建立了一种用于早期疾病诊断的非破坏性工具。

引言

苹果树（Malus domestica）是全球最重要的经济作物之一[1]。然而，由Botryosphaeria dothidea（以下简称B. dothidea）引起的苹果枝溃疡病严重阻碍了树木生长，降低了产量，最终可能导致大量枝条死亡[1]。尽管该病普遍存在，但目前对B. dothidea感染过程及其在苹果枝条中的相关防御机制的理解仍然有限，这在很大程度上是由于分析方法不足[2]。阐明表皮和皮层中角质层和细胞壁防御成分的微观时空动态，以及B. dothidea感染期间小分子的代谢重编程，对于揭示病原体的感染策略、明确宿主防御反应以及指导有效管理策略的开发至关重要。

苹果枝条的微观结构从外到内包括表皮、皮层、维管组织、维管形成层和髓[3]。表皮是抵御B. dothidea入侵的第一道防线[4]，[5]，其中表皮上层的角质层结构和下层表皮细胞的动态响应机制在抗病性中起着关键作用[3]，[6]，[7]。当病原体试图穿透表皮时，角质层聚合物和蜡的合成会增加以增强屏障效应[8]。紧密排列的下层表皮细胞通过机械阻力限制病原体的入侵[9]。皮层构成了抵御B. dothidea入侵的第二道防线[1]，[10]，其细胞壁结构成分主要包括木质素、纤维素、半纤维素、果胶和酚类化合物等天然大分子，这些成分在抵御生物胁迫中发挥重要作用。植物细胞壁通过木质素沉积、果胶甲基化以及纤维素微纤丝重组来增强结构抗性[3]，[11]，[12]。

角质层和细胞壁中存在的天然大分子具有不同的聚合度，在溶解过程中常常会发生降解，这对传统的湿化学分析方法提出了重大挑战[13]。因此，开发一种原位、高精度的成像技术对于它们的表征至关重要。在细胞水平上，常用的方法包括组织化学染色和免疫标记技术[14]、质谱成像[15]、荧光成像[16]、傅里叶变换红外光谱（FTIR）成像[17]和拉曼成像[18]等[19]，[20]。然而，每种方法都有其固有的局限性：组织化学染色需要破坏性标记和样品制备[14]；质谱提供高通量但空间分辨率不足[21]；荧光成像具有优异的灵敏度但依赖于分析物特异性标记[16]；FTIR成像技术易受水干扰[17]。尽管近年来这些方法有了显著进步[16]，[17]，但在提供细胞尺度上细胞壁结构成分的全面时空信息方面仍面临挑战。

共聚焦拉曼显微光谱（CRM）成像结合了高空间分辨率和分子指纹识别能力，能够在亚微米尺度上对植物组织角质层和细胞壁中多种化学成分的时空分布进行原位、非破坏性和同步分析[18]，[22]。其应用已扩展到多种植物物种，如黄瓜[23]、番茄[24]、[25]、云杉[26]以及各种水果和树木[27]，[28]，[29]，揭示了病原体感染等生理过程中的生物聚合物的时空变化。尽管具有这些优势，CRM仍面临信号噪声比低和复杂生物样品中光谱干扰等问题[30]。为了解决这些限制，化学计量学在从拉曼数据集中有效提取微妙的空间和化学信息方面被证明是必要的。最近的研究证明了化学计量学辅助CRM在植物系统中的高分辨率细胞成像中的有效性[27]，[31]，[32]。例如，我们的团队应用这种方法评估了苹果果实环腐病中纤维素、低甲基化果胶、高甲基化果胶、木质素和酚类在细胞水平上的时空变化[27]。

然而，在病原微生物感染的研究中，现有关于使用CRM进行原位细胞壁成像的文献很少同时关注细胞内和细胞外小分子代谢物的动态变化。这一限制阻碍了对病原机制和相应宿主防御反应的全面理解。在B. dothidea引起苹果枝溃疡病的情况下，不仅需要使用化学计量学辅助CRM建立角质层和细胞壁关键结构成分的原位高分辨率成像，还需要系统地表征和分析疾病进展过程中发生的代谢变化。

可以使用先进的代谢组学技术阐明植物细胞内外小分子代谢物的动态变化[33]，[34]，[35]，[36]。代谢组学在揭示植物-病原微生物及其宿主之间的相互作用方面取得了重要进展[37]，[38]，[39]。例如，Gao等人使用非靶向HPLC–Q–TOF–MS代谢组学鉴定了Astragalus对Fusarium oxysporum感染的关键差异代谢物[39]。这些研究表明，代谢组学不仅可以准确表征植物病原微生物的感染特征，还可以实现识别与植物抗性相关的生物标志物和阐明宿主-病原体相互作用代谢机制的任务。预计非靶向代谢组学[40]可以用于尽可能多地识别和分析苹果枝溃疡病过程中的小分子代谢物变化。

此外，苹果枝溃疡病的早期诊断（在症状出现之前）对于农业实践中的有效控制至关重要。然而，目前尚无合适的生物标志物可用于其早期和定量检测。考虑到拉曼光谱可以反映各种化学成分的信息，预计可以基于机器学习结合拉曼光谱构建苹果枝溃疡病的早期诊断分类预测模型。

因此，本研究重点关注由B. dothidea感染引起的苹果枝溃疡病过程。利用CRM结合化学计量学，建立了一种无标记、原位、高通量、精确的成像方法，用于表征角质层和细胞壁中的主要防御成分。该方法用于依次评估这些关键成分在表皮和皮层中的微观时空变化。同时，使用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱质谱仪（UPLC–Q–Orbitrap–MS）结合无监督机器学习对细胞内和细胞外小分子代谢物进行非靶向代谢组学分析。此外，还开发了一种结合拉曼光谱与机器学习的苹果枝溃疡病早期诊断模式识别方法。本研究的主要框架如图1所示。

材料与试剂

纤维素（α-纤维素，≤25 μm）、果胶（半乳糖醛酸≥74.0%）、木聚糖和棕榈酸标准品购自Aladdin（上海，中国）。松醛标准品购自Titan Technology（上海，中国）。乙醇（AR级，75%）、甲醇（≥99.9%）和甲酸（≥99.9%）购自Thermo Fisher（美国麦迪逊）。

B. dothidea培养和感染实验

培养的B. dothidea被接种到红富士苹果树的枝条上以构建病原体感染样本，同时设置阴性对照样本

枝条角质层和细胞壁的波段分配

仪器测量参数的优化结果如图S1所示，最佳激光功率选为5 mW，单次光谱采集时间为60秒。通过比较果胶、纤维素、木聚糖、棕榈酸和松醛的标准光谱，识别出低甲基化果胶（LMP，酯化程度<50%）、高甲基化果胶（HMP，酯化程度>50%）、纤维素、半纤维素、脂质和木质素的特征振动模式

结论

总之，本研究引入了化学计量学辅助的共聚焦拉曼显微光谱成像技术，建立了一种无标记、原位、高通量、精确的成像方法，用于检测B. dothidea感染期间苹果枝条角质层和细胞壁中的主要成分（脂质、木质素、酚类、纤维素、半纤维素、LMP和HMP）。这些成分的微观时空变化沿感染路径从外向内依次进行了评估

CRediT作者贡献声明

姜英芳：撰写——原始草稿、研究、正式分析、数据管理。李梅：正式分析。刘海莎：验证。蒋金光：正式分析。陈东梅：撰写——审稿与编辑、资源获取、资金筹集。严秀芳：撰写——审稿与编辑、资金筹集。康超：撰写——审稿与编辑、方法学、资金筹集、概念构思。刘雅娟：撰写——审稿与编辑、软件、正式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金[项目编号22464006、22367004和32560414]、贵州省基础研究计划（自然科学）[项目编号QKHJC-ZK[2024]Key003]以及贵州省重点实验室平台项目[项目编号ZSYS[2025]008]的支持。