《Cell Discovery》：Integrative spatial profiling pipeline for determining TME architectures in archival clinical specimens using CmTSA superplex technology
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本综述系统介绍了一种针对石蜡包埋档案临床标本的整合空间分析平台。该平台融合了新型混合光化学荧光淬灭与循环多重酪胺信号放大技术，实现了对肿瘤微环境中30-60个生物标志物的高信噪比、高通量超多重成像。结合计算机视觉（深度学习细胞分割、表型注释规则）与半径约束邻域网络空间分析方法，该工作流程能够从原始像素数据中提取单细胞空间图谱，定义具有生物学和预后相关性的空间一致性功能龛，为肿瘤免疫学研究和精准免疫治疗提供了一个强大的可视化与量化框架。
引言
肿瘤的持续存在、播散和治疗反应不仅受恶性细胞内在特性的影响，也受到其与微环境中多种非恶性组分（包括免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和其他基质细胞）相互作用的影响。全面理解癌症和开发有效疗法需要对肿瘤细胞与其周围微环境之间复杂的、多向的相互作用和信号网络进行研究。单细胞RNA测序（scRNA-seq）在过去十年中被广泛用于绘制各种癌症中肿瘤、免疫和基质细胞的基因表达谱，但这些技术缺乏关键的空间信息。肿瘤作为一个由异质细胞类型组成的生态系统，细胞间动态相互作用、交换信息，并影响疾病进程和治疗结果。使用苏木精和伊红（H&E）染色的传统组织架构分析，虽然对识别恶性程度至关重要，但常常忽略了肿瘤细胞与其他细胞类型之间的空间相互作用。因此，在单细胞水平上保存并揭示肿瘤空间特征的分子研究，对于理解细胞间通讯如何影响肿瘤生长和治疗反应至关重要。
对患者肿瘤生态系统空间特征的剖析始于原位细胞表型的鉴定。主要有两种主流技术可用于此目的：空间转录组学和空间蛋白质组学。尽管空间转录组学能提供更多的细胞内分子信息，但其有限的通量使得在临床队列水平评估和比较肿瘤微环境中各种细胞类型之间的空间相互作用具有挑战性。此外，基于mRNA的检测方法由于mRNA的不稳定性，在应用于常规临床样本时面临实际挑战。因此，基于单细胞分辨超多重蛋白成像的蛋白质组学更适合此目的。它与来自大型队列的常规临床样本兼容，能够区分数十种标志物（>30种生物标志物），足以表征肿瘤生态系统内的细胞表型和状态。基于读出信号，空间蛋白质组学技术可分为两类：质谱法（如IMC和MIBI-TOF）以及荧光或显色成像法（如CODEX、CycIF和多重免疫组化）。每种方法在分辨率、多重能力、效率和信号放大方面各有独特的优缺点。然而，当应用于临床样本时，现有技术面临重大挑战，包括高背景噪声、低通量、低信号强度、高成本以及与常规一抗不兼容。这些问题限制了它们在临床环境中的有效性和可及性，阻碍了其在大规模队列研究中的应用。因此，迫切需要开发新方法来克服这些挑战，提高TME空间分析过程的可靠性、效率和可负担性。
空间蛋白质组学技术能够在组织切片上可视化数十到数百种标志蛋白，涉及多达数百万个细胞。这个庞大的像素数据集包含了表征患者TME的多维信息，包括单细胞表型、单细胞形态、组织中的细胞组成、细胞间相互作用以及它们排列成多细胞龛或更大解剖/功能结构的方式。然而，从原始像素数据中提取这些特征并非易事，需要专门的、连接显微镜学、病理学和计算机科学世界的分析方法。机器学习模型（如Cellpose和StarDist）能够实现准确的细胞分割和分类，将基于像素的高重成像数据转化为数字化的、基于矩阵的空间数据。这些基于计算机视觉的方法在与真实数据的人工分割进行比较时，可以达到与人相当的精度。然而，TME内的细胞通常密集堆积、形态不规则并表达多种细胞标志物，因此分割和细胞表型分析工作流程需要精心实施标准化的、基于阈值的门控流程，并与严格的注释规则相结合。
此外，从这种新型数据类型中推导出生物学和临床见解仍然是一个持续的研究挑战。为了表征肿瘤内细胞类型之间的空间相互作用，已经引入了许多计算平台。一些平台侧重于基于空间共现频率、空间相关性或单个细胞间最近距离的细胞类型之间的成对关联。其他平台则使用机器学习（如K-means）或主题建模来定义具有一致细胞类型组成的组织细胞龛。这些平台主要关注局部区域，而非全视野病理切片，并且缺乏全面理解患者免疫微环境空间特征的策略。这种局限性阻碍了对个体免疫状态的全面和系统评估。
结果
HOC-FD整合自体荧光淬灭与CmTSA染色用于档案FFPE切片
常规FFPE切片在宽发射光谱范围内表现出显著的自体荧光，其发射光谱与常用荧光团的发射光谱重叠，严重影响了检测特异性。为了解决这个问题，我们开发了HOC-FD——一种结合了特定光漂白和化学淬灭的方法。在消除背景荧光后，脱蜡的FFPE切片在含有4%过氧化氢的溶液中被均匀照射。LED光激发背景荧光分子，过氧化氢发生光解生成羟基自由基。这些自由基与激发的荧光团发生氧化还原反应，改变其分子结构，并通过破坏能量跃迁来淬灭荧光。8分钟的HOC-FD处理消除了FFPE切片中>90%的可见光范围背景荧光，且不损害免疫荧光的抗原检测。进一步评估证实了与后续IF和共价TSA染色的兼容性，使得基于FFPE的荧光工作流程的信噪比提高了50%–80%。
光谱拥挤仍然是超多重荧光标记（>30个标志物）的一个关键瓶颈。当前方法主要使用预偶联一抗的循环直接标记方法。虽然实现了超多重，但这些技术由于缺乏二级级联放大，需要提高一抗浓度。这种固有的局限性加剧了背景荧光并降低了特异性阈值，特别是在检测低丰度细胞内抗原或分析人类FFPE档案样本时。相比之下，酪胺信号放大（TSA）——一种利用酪胺-HRP反应的催化标记方法——能够在最小抗体结合的情况下实现高度特异性的荧光团沉积，同时在相同条件下将信号比常规免疫荧光放大5-100倍。TSA通过酶促信号增强有效避免了弱标记伪影；然而，其多重潜力仍受限于传统光谱解混算法有限的区分带宽（<9个通道）。为了克服这些技术限制，同时保留对档案FFPE组织表型分析的超多重能力，我们开发了一个整合框架，协同HOC-FD介导的迭代光谱成像与多重TSA共检测。这种方法通过三个循环应用的步骤实现了理论上无限的多重：首先，对制冷LED光源进行光谱优化，在10分钟内实现了99%的荧光淬灭，同时保留了DAPI核信号。接着，每个染色循环生成三重荧光图像，其中DAPI作为配准的不变基准标记。最后，使用尺度不变特征变换（SIFT）键计算融合连续图像以实现像素级对齐精度。经过20个淬灭循环的验证，证实没有发生显著的抗原性损失。
从FFPE切片的高质量超多重图像生成单细胞空间图谱
在CmTSA工作流程中，荧光团通过酪胺沉积共价锚定在抗原上，而抗体则通过非共价力结合。这种共价与非共价结合的二分法使得在保留荧光团的同时选择性剥离抗体成为可能——这是TSA迭代染色的关键优势。然而，传统的剥离方法存在抗原表位变性和组织形态破坏的风险，从而将迭代染色限制在少于10个标志物。为了最大限度减少损伤同时提高共标记通量，我们开发了一个标准化的筛选工作流程，以筛选具有高特异性和低亲和力的抗体。这些筛选出的抗体允许精确的TSA标记，并能使用离子缓冲液温和去除。通过表位稳定性、细胞形态和组织完整性评估验证，这种方法支持在单个FFPE切片上共标记至少40个生物标志物。从理论上讲，CmTSA平台支持≥20个迭代染色循环，可在全FFPE切片范围内以单细胞分辨率产生60通道超多重图像。然而，对此类数据集进行手动分析在操作上不可行，因此需要实施人工智能驱动的计算流程。第一项基本任务是准确的细胞分割。我们为此目的测试并应用了多种深度学习模型，例如StarDist和CellPose。StarDist使用星形凸多边形表示细胞，通过从中心点延伸出的多条射线来近似每个细胞的形状，从而描绘细胞边界。该模型特别适用于分割复杂TME中形态多样的细胞，这些细胞密集排列且经常重叠。我们在QuPath分析平台上实施了用于染色人类FFPE组织切片图像核分割的StarDist预训练模型，获得了令人满意的分割精度。
细胞分割后，细胞类型注释涉及两个主要步骤，我们称之为细胞门控策略：首先，确定单个细胞中细胞标志物的表达水平，获得单个阳性标记细胞。通过荧光信号揭示的细胞标志物表达模式各异。应用此方法时必须仔细考虑几个关键问题。一些标志物在细胞膜上表达，一些在细胞质中表达，另一些在细胞核中表达。必须根据单个标
