《Journal of Pineal Research》：Melatonin Is Bound to a Glycolytic Protein Complex via Tdh2p During Fermentation in Saccharomyces cerevisiae
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这篇研究揭示了酿酒酵母在酒精发酵过程中，褪黑素通过与糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶2同工型特异性结合，形成一种蛋白复合物。该工作证实了Tdh2p是该复合物形成的枢纽，其缺失导致复合体解离。分子对接预测了二者稳定的氢键作用。研究为理解褪黑素调控微生物能量代谢的分子机制提供了新见解。
糖酵解蛋白复合物在酿酒酵母中的存在
先前的研究曾描述过褪黑素与多种糖酵解蛋白的相互作用。本研究进一步旨在确定在酿酒酵母葡萄酒菌株Lalvin CLOSTM的酒精发酵过程中，烯醇化酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶在细胞内是否相互结合。为此，研究者在发酵不同时间点获取的细胞内蛋白提取物，分别使用抗烯醇化酶或抗GAPDH抗体进行了共免疫沉淀分析。Western Blot分析证实，在所有发酵阶段的样品中，这两种蛋白的细胞内浓度具有可比性。通过抗GAPDH抗体进行免疫沉淀，结果显示在酒精发酵过程中，有多种蛋白与GAPDH相关联。对这些免疫纯化的复合物进行Western Blot分析，在约47 kDa处出现了一条对应于烯醇化酶的条带。反之，用抗烯醇化酶抗体进行免疫沉淀，与烯醇化酶结合的蛋白较少，但Western Blot分析在约35 kDa处显示出一条对应于GAPDH的条带。这些结果证明，在Sc Clos菌株的酒精发酵过程中，烯醇化酶和GAPDH是同一个细胞内蛋白复合物的一部分。糖酵解蛋白相互作用组的研究，对于阐明其功能和调控机制至关重要。这项发现与在其他物种中的观察一致，提示糖酵解酶之间可能形成多酶复合体，以促进代谢效率。
糖酵解基因缺失菌株的发酵行为
在探讨这些相互作用的功能意义之前，首先需要表征糖酵解基因缺失菌株的发酵行为。因此，本研究描述了单基因和双基因缺失对酵母生长和发酵进程的影响。实验在单倍体实验室菌株BY4741及其各种单、双基因缺失突变体中进行。根据缺失基因的不同，观察到不同的发酵行为。缺失PYK2或TDH1基因的突变体表现出与野生型相似的发酵行为。相反，缺失TDH2或TDH3基因的突变体发酵延迟，其中tdh3Δ突变体受影响最明显，表现为更长的滞后期。所有三个TDH双突变体都表现出不同程度的发酵延迟，其中tdh2Δtdh3Δ双突变体延迟最为严重。有趣的是，缺失ENO1基因的突变体比野生型更早开始生长和发酵，但生长显著减弱，导致发酵过早停止。为了验证这些结果，研究团队利用CRISPR-Cas9技术，在二倍体葡萄酒菌株Sc Clos中构建了相同的tdh单、双基因缺失突变体。与实验室菌株相比，葡萄酒菌株中突变体与野生型在生长和发酵动力学上的差异较小，但趋势一致：tdh3Δ突变体受影响最大，而在评估的两个双突变体中，tdh2Δtdh3Δ菌株表现最差。这些结果证实了TDH2和TDH3，特别是TDH3，在以葡萄糖为碳源生长的细胞中扮演着关键角色。
与褪黑素结合的蛋白分析
研究测定了不同tdh突变体在发酵过程中不同时间点的细胞内和细胞外褪黑素含量。Sc Clos tdh2Δ突变体显示出比其他突变体和野生型更高的褪黑素水平。为了确定在特定基因缺失情况下，褪黑素是否仍与糖酵解蛋白结合，研究者分析了不同BY4741突变体发酵过程中与褪黑素结合的蛋白。除了tdh2Δ突变体外，对照BY4741菌株与大多数单突变体显示出相似的蛋白结合模式，而tdh2Δ突变体几乎没有检测到蛋白结合。在TDH双基因突变体的分析中，只有在tdh1Δtdh3Δ菌株中检测到褪黑素与糖酵解蛋白的结合，而在tdh1Δtdh2Δ或tdh2Δtdh3Δ菌株中则未检测到。这些结果表明，褪黑素似乎只与Tdh2p结合，而Tdh2p似乎是蛋白复合物的一部分。因此，在缺乏Tdh2p的情况下，复合物中的其他蛋白在凝胶上就观察不到了。为了验证这一结论，研究也在Sc Clos菌株及其糖酵解突变体中进行了相同分析，结果完全一致：在所有缺失TDH2基因的突变体中，均未检测到褪黑素与蛋白的结合，这证实了TDH2基因的存在对于褪黑素与糖酵解复合物的结合至关重要。值得注意的是，即使在褪黑素与糖酵解蛋白结合减少或未检测到的突变体中，发酵也能完成，且乙醇产量相当，表明褪黑素-蛋白相互作用并非酒精发酵所必需。
为了区分三种Tdh蛋白并确定它们是否都参与糖酵解复合物，研究者使用了带有GFP标签的Tdh2p菌株进行发酵实验。Western Blot分析显示，尽管Tdh2p对于褪黑素结合至关重要，但Tdh1p和/或Tdh3p也存在于复合物中。在GFP标记的Tdh2p菌株中，除了在约64 kDa处观察到Tdh2p-GFP条带，在约34 kDa处还观察到了对应于Tdh1p或Tdh3p，或可能两者皆有的条带。随后，通过质谱分析鉴定了Sc Clos发酵过程中与褪黑素结合的蛋白。共鉴定出16个蛋白条带，其中大部分属于糖酵解途径，包括此前已鉴定的蛋白以及新发现的磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶和磷酸丙糖异构酶。此外，还鉴定出来自其他代谢途径的组分，如脂肪酸代谢、翻译延伸因子、分子伴侣和核糖体蛋白。这些被鉴定出的蛋白与先前研究中描述的酵母“糖酵解体”中的蛋白高度重合，暗示褪黑素可能在代谢调控中扮演重要角色。多种糖酵解酶通过相分离关联，可能起到增强整个通路活性、提高能量生产关键反应速率的作用，从而在缺氧应激下形成所谓的“代谢区室”。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶酶活分析
为了确定TDH1、TDH2和TDH3基因缺失对酶活性的影响，研究者测量了Sc Clos野生型及tdh突变体在发酵过程中的GAPDH活性。在野生型菌株中，GAPDH活性在指数期增加，在24小时达到最大值，然后在酵母进入稳定期时下降。因此，选择24小时这个最大酶活性时间点来测定不同tdh突变体的GAPDH活性。与野生型相比，tdh1Δ突变体未观察到显著差异，但其他突变体则不同：tdh2Δ、tdh3Δ和tdh1Δtdh2Δ突变体的GAPDH活性下降了一半，而tdh2Δtdh3Δ突变体的活性下降了75%。tdh1Δ突变体的GAPDH活性结果与先前研究一致，表明该基因可能在细胞中具有不同功能。然而，在tdh2Δtdh3Δ双突变体中，与野生型相比仍有一些残余活性，这可能由TDH1接管。TDH2基因缺失对GAPDH活性的显著影响，在不同菌株背景中结果不尽相同，表明其影响具有菌株依赖性。对于tdh3Δ突变体，本研究与先前研究结果一致，其GAPDH活性相比野生型下降了一半。
褪黑素与Tdh2p的分子对接
上述结果表明褪黑素通过Tdh2p与糖酵解酶相互作用。因此，研究者使用SwissDock程序对褪黑素与Tdh2p进行了分子对接分析。共生成253个构象，并选择了吉布斯自由能最低的构象。使用UCFS Chimera程序分析该对接结果，预测了褪黑素与Tdh2p之间可能形成的距离小于2 ?的键合。结果表明，褪黑素可能与Tdh2p的Arg11和Asn314氨基酸的主链形成两个氢键，这提示褪黑素与Tdh2p之间的相互作用非常稳定。
结论
本研究证实了酿酒酵母中糖酵解蛋白复合物的存在，烯醇化酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶是其组成部分。该复合物最近被证明在酒精发酵过程中与褪黑素结合。此处，研究进一步证明Tdh2p在这一相互作用中起着关键作用，因为TDH2基因的缺失会破坏褪黑素的结合，突显了Tdh2p对于糖酵解蛋白-褪黑素复合物的形成至关重要。分子对接分析预测褪黑素通过稳定的氢键与Tdh2p相互作用。尽管破坏褪黑素-蛋白复合物并未导致发酵进程的重大改变，但先前结果提示这种相互作用可能对碳代谢具有潜在的调节作用。需要进一步的研究来阐明褪黑素与糖酵解蛋白复合物相互作用的生理相关性及其调控机制。
