辣椒果实着色的协同调控机制：GLK2与PRR2的互作及其对色素合成的决定性作用

《The Plant Journal》：The combined effects of Golden2-like 2 and Pseudo-Response Regulator 2 control the fruit pigmentation in pepper

本文深入探讨了GLK2与PRR2在调控辣椒果实色素形成中的协同效应。研究发现，二者共同决定了控制果实成熟与未熟果颜色的关键基因座c1。通过自然变异与基因沉默实验，证实GLK2与PRR2的联合变异可导致未熟果呈淡绿色，并影响成熟果色泽，其机制涉及叶绿体大小、类囊体数量及色素合成基因表达的显著下调。文章不仅揭示了这两种转录因子在物理上的相互作用，还为通过遗传手段改良辣椒果实品质性状提供了重要的理论基础。

　　

未熟与成熟果实颜色的协同调控

GLK2与PRR2的无义突变导致叶绿素含量显著降低的淡绿色果实与c1表型

先前研究发现，“Habanero peach”中的prr2突变导致了桃色果色，这与质体发育和色素合成减少有关。为了进一步验证PRR2的功能，研究人员在C. annuum “Numex halloween”（简称NH）中进行了病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验。有趣的是，尽管NH的PRR2存在一个导致提前终止密码子的无义突变，其PRR2沉默植株的未熟果和成熟果颜色与对照相比均无可见差异，这暗示可能存在其他因子与PRR2协同调控色素沉着。NH的PSY1基因存在大片段的缺失。对包括GLK2、LOL1、CaPP2C35在内的多个控制未熟果颜色的候选基因进行测序分析，在NH、“Habanero orange”（HO）和“Habanero peach”（HP）中发现了PRR2和GLK2的序列变异，但未在LOL1和CaPP2C35中发现变异。

为了探究GLK2和PRR2在未熟果颜色上的遗传关系，研究人员分析了30个辣椒种质。结果表明，GLK2/PRR2组合产生绿色未熟果；GLK2/prr2组合也产生绿色未熟果（如NH）；glk2/PRR2组合则主要产生浅绿色未熟果（如多数相关种质，HO除外）。而同时携带glk2和prr2变异的种质（如“Goshiki”、HP等）则表现出叶绿素含量极低的淡绿色未熟果。这些淡绿色种质中的GLK2和PRR2蛋白预计都因提前终止密码子而缺失了保守的GCT框结构域。

为了验证淡绿色果色与glk2/prr2的关联，研究人员构建了来自“Milyang”（GLK2/PRR2，绿色果）和“Goshiki”（glk2/prr2，淡绿色果）杂交的F₂群体。F₂个体的未熟果颜色发生分离，从绿色到淡绿色。GLK2和PRR2等位基因的分离与未熟果颜色高度相关，其中GLK2的影响似乎比PRR2更显著。在多种辣椒种质中进一步检查GLK2、PRR2、PSY1和CCS的变异发现，这些基因的无义和移码突变共同决定了果实的颜色表现。例如，GLK2/PRR2/PSY1/CCS（如“Royal black”）产生红色成熟果；glk2/prr2/PSY1/CCS（如“Numex centennial”）也产生红色成熟果。结合GLK2/PRR2，psy1/CCS导致橙色成熟果（如IT250176），PSY1/ccs决定橙黄色果（如IT237362）。psy1/ccs导致柠檬黄色果（如IT231169）。结合psy1/CCS，glk2/PRR2（HO）和GLK2/prr2（NH）均表现出橙色成熟果。三重突变glk2/prr2/psy1（HP）产生桃色果，而四重突变glk2/prr2/psy1/ccs（IT158782）导致白色成熟果。这些结果共同表明，GLK2和PRR2协同调控果实色素沉着。

在PRR2突变的NH中沉默GLK2导致果色变化

为了确定GLK2和PRR2对果色的共同影响，研究人员进行了诱导双重变异的VIGS实验。在NH中沉默GLK2，导致了淡绿色的未熟果和桃色的成熟果。叶片中沉默GLK2未见明显变化，而沉默GLK1的叶片则呈现淡绿色且叶绿素和类胡萝卜素显著减少。透射电子显微镜（TEM）分析显示，GLK2沉默的NH果实的叶绿体面积比对照小2.4倍，每个基粒的类囊体数量比对照少3.5倍。在GLK2沉默的NH未熟果中，叶绿素a和b、叶黄素和β-胡萝卜素的含量均显著低于对照。在成熟果中，辣椒红素的含量也显著降低。在未熟果中，叶绿素合成基因HEMA、CHLH、CRD、DVR、PORB和CAO的表达在GLK2沉默的NH中显著下调。在成熟果中，PSY1表达下调，而CCS表达上调。

在GLK2突变的HO中沉默PRR2导致果色变化

在HO中沉默PRR2，同样观察到了淡绿色未熟果和桃色成熟果。TEM分析表明，PRR2沉默的HO果实的叶绿体面积和每个基粒的类囊体数量均显著小于对照。色素含量分析显示，其未熟果的叶绿素a、b，叶黄素，β-胡萝卜素以及成熟果的辣椒红素和玉米黄质含量均大幅降低。基因表达分析发现，与GLK2沉默的NH不同，PRR2沉默的HO中，部分叶绿素合成基因（CHLH、DVR、CAO）表达未改变，而CHLM和CHLG表达显著降低，且叶绿素a/b比值下降。类胡萝卜素合成基因PSY1、PDS、ZISO、LCYB1、LCYB2、ZEP和CCS的表达在PRR2沉默的HO成熟果中均显著下调。

GLK2和PRR2的双重变异影响成熟果的风味挥发物

利用固相微萃取-气相色谱-质谱联用（SPME-GC-MS）分析了双重变异果实中的挥发性化合物。结果表明，GLK2沉默的NH和PRR2沉默的HO果实中，多种风味挥发物的积累发生了改变。这些变化可分为三组：第一组在两种双重变异果实中呈现相似变化，如甲基水杨酸增加，罗勒烯醇、莳萝醚、对薄荷-1-烯-9-醛减少；第二组仅在GLK2沉默的NH中发生显著变化；第三组则仅在PRR2沉默的HO中检测到变化。这些结果表明，GLK2和PRR2协同调控成熟果实中的风味挥发物。

在RB中共沉默GLK2-PRR2及在NH中共沉默GLK2-CCS降低了未熟果和成熟果的叶绿素与类胡萝卜素水平

结合自然变异与基因沉默，GLK2和PRR2的双重变异降低了NH和HO果实的色素沉着。为了进一步证实这种遗传互作，研究人员在RB（GLK2/PRR2）中共沉默了GLK2和PRR2。结果表明，共沉默导致了淡绿色未熟果，而单独沉默GLK2导致浅绿色未熟果，单独沉默PRR2则不影响色素。在成熟果阶段，所有处理（单沉默或共沉默）均呈现红色，视觉上难以区分。色素含量测定显示，GLK2-PRR2共沉默的RB未熟果中，叶绿素a、b，叶黄素，β-胡萝卜素含量极显著降低；在成熟果中，玉米黄质和β-胡萝卜素含量也显著降低。基因表达分析发现，GLK2-PRR2共沉默的RB中，多数叶绿素合成基因（HEMA、CHLM、CRD、DVR、PORB、CAO、CHLG）和类胡萝卜素合成基因（PSY1、ZISO、CHY2、ZEP）表达显著下调。

先前模型表明c1c2y基因型产生白色成熟果，而携带四重突变glk2/prr2/psy1/ccs的IT158782正是白色果。在NH（prr2/psy1）中共沉默GLK2和CCS，也成功获得了白色成熟果。色素分析证实，GLK2-CCS共沉默的NH和IT158782的成熟果中均未检测到类胡萝卜素。

GLK2与PRR2发生相互作用

通过酵母双杂交（Y2H）实验证明了GLK2与PRR2之间存在直接的物理相互作用。缺失GCT框的截短蛋白GLK2_ΔGCT和PRR2_ΔGCT则几乎丧失了这种互作能力。双分子荧光互补（BiFC）实验进一步在植物原生质体中验证了GLK2与PRR2在细胞核内的相互作用。这些结果表明，GLK2很可能通过其GCT框与PRR2发生相互作用。

讨论

多样的果实颜色是满足人类不同偏好的必要条件。我们之前鉴定出PRR2是未熟果和成熟果色素沉着的正向调节因子，并确定其与c1基因座相关。然而，在NH（psy1/CCS）中沉默PRR2并未改变果色，这与之前的果实颜色模型存在矛盾。对包括GLK2在内的其他候选基因的分析表明，GLK2是番茄、辣椒等多种植物中色素积累的正向调节因子。在辣椒中，CaGLK2的表达模式与番茄SlGLK2不同，而PRR2在两者中表达水平均较低。在RB中单独沉默GLK2或PRR2不影响营养组织的色素沉着，这表明这两个基因具有空间特异性调节功能。

携带glk2/prr2的辣椒种质表现出淡绿色未熟果，而单基因变异（GLK2/prr2或glk2/PRR2）的种质颜色较浅。F₂群体分析也证实，glk2和prr2的纯合基因型导致淡绿色未熟果。在NH和HO中，GLK2和PR