甲状腺激素合成干扰化学物检测的离体大鼠模型优化及其功能评估

《Toxicology Reports》：Optimization of an ex vivo model to test the ability of chemicals to disrupt thyroid hormone synthesis

本研究针对现有二维细胞模型难以模拟甲状腺激素合成所需三维结构的局限，建立了一种优化的离体大鼠甲状腺模型。通过在StemPro?-34培养基中添加碘化物和5 mU/mL的TSH，并使用滤膜插片进行培养，该模型可维持甲状腺组织形态并支持稳定的T4（甲状腺素）合成。使用抗甲状腺药物甲巯咪唑（MMI）挑战模型，显著降低了T4的释放，并上调了Tpo和Slc5a5(NIS)的基因表达。该优化模型对甲状腺激素合成抑制剂具有敏感性，为研究甲状腺干扰物的作用机制提供了有前景的功能性离体模型。

甲状腺激素对身体的正常生长发育和代谢调控至关重要，然而，许多外源化学物质（即内分泌干扰物）可能会干扰其合成。传统上，科学家们常利用二维细胞培养模型来研究这些化学物对甲状腺功能相关酶和转运体的影响，但这些系统通常缺乏产生激素所必需的复杂三维组织结构。虽然近年来发展出了一些有前景的三维模型，但它们或依赖稀缺的材料，或操作极为复杂耗时。为了填补这一空白，研究人员将目光投向了能够保留天然组织结构的离体培养模型。这种模型在评估化学品毒性方面具有独特优势，因为它既能反映组织的生理复杂性，又避免了体内实验的伦理和复杂性挑战。然而，现有的许多离体模型在持续产生并分泌关键甲状腺激素——甲状腺素（T₄）方面的能力尚未得到充分验证，而这是评估甲状腺功能的关键指标。为了解决这些模型在评估甲状腺激素合成与分泌方面的不足，Mikala Melchiors、Mette Stub、Louise Ramh?j、Eleni Barmpari、Kieu-mi Tran、Anna Opstrup Bindel、Anna Kjerstine Rosenmai和Terje Svingen在《Toxicology Reports》上发表了一篇研究，旨在建立并优化一种能够稳定合成T₄，并能通过测量培养基中T₄输出来检测甲状腺激素合成干扰的离体大鼠甲状腺培养方案。

研究者运用了几项关键技术来建立和评估这个模型。首先，他们建立了离体甲状腺组织培养体系，从出生后第6天（PD6）的斯普拉-道利（Sprague Dawley）大鼠幼崽中分离出甲状腺，在特定培养基中培养7或9天。其次，他们通过酶联免疫吸附测定（ELISA）来定量检测培养基中累积的T₄浓度，这是评估甲状腺合成功能的核心指标。再次，他们对培养后的组织样本进行苏木精-伊红（H&E）染色，通过组织病理学分析评估甲状腺滤泡的形态和组织的完整性。此外，他们还通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，定量分析了一系列与甲状腺激素合成和细胞凋亡相关基因的表达水平，包括甲状腺过氧化物酶基因（Tpo）、钠碘转运体基因（Slc5a5 (NIS)），以及凋亡标志物基因Bax和Bcl-2。

3.1. 选择培养基和培养方法

研究者首先通过组织形态学结果来优化培养基和培养方法。他们比较了RPMI和StemPro?-34两种培养基，以及悬滴培养和滤膜插片培养两种方法。组织学评估显示，采用悬滴法培养的甲状腺组织保存状况不佳，出现大面积坏死，且无法区分甲状腺滤泡。相比之下，在滤膜插片上培养的样品，其结构完整性更好，两种培养基下均能观察到清晰的滤泡结构。然而，在RPMI培养基中培养的样品中，至少有一半出现了早期自溶（细胞变性）的迹象。值得注意的是，在StemPro?-34培养基中、于滤膜插片上培养的甲状腺组织，保持了最规则的滤泡结构，具有界限分明的胶体填充腔，滤泡上皮的变化（如空泡形成和/或肥大）最轻微，自溶迹象也最少。因此，StemPro?-34培养基结合滤膜插片培养法被选为后续实验的条件。

3.2. 为培养选择甲状腺刺激激素浓度

在确定了培养基和培养方法后，下一个优化的参数是甲状腺刺激激素（TSH）的浓度，目标是维持接近正常甲状腺的组织形态，同时确保模型支持强劲的T₄合成。在初步测试了0、0.1、1和10 mU/mL的TSH后，研究发现1和10 mU/mL的浓度在培养第3天时能诱导T₄释放达到峰值，之后逐渐下降，这可能与滤泡中预合成激素的释放有关。为了专注于新合成，研究将培养期延长至9天，并测试了1、5和10 mU/mL TSH，同时添加1 μM碘化钾（KI）以防止长期培养中碘缺乏。组织学评估显示，在不添加碘的情况下，增加TSH水平会导致滤泡上皮细胞明显活化，表现为胶体耗竭、滤泡形状不规则和上皮细胞高度增加。添加碘后，高TSH浓度引起的形态变化较小。T₄测量显示，5 mU/mL TSH能产生最高的T₄输出，而碘的添加似乎不影响T₄水平。基于这些结果，5 mU/mL TSH加1 μM KI被选为后续实验的优化条件。

3.3. 甲巯咪唑暴露后的组织学评估

在优化了所有培养参数后，研究者用抗甲状腺药物甲巯咪唑（MMI）来挑战模型，以测试其对甲状腺激素合成干扰的敏感性，因为MMI具有明确的作用靶点——抑制TPO活性。暴露于递增浓度的MMI9天后，甲状腺组织出现了明显的组织学改变。更高的MMI浓度会诱导出不规则的滤泡结构、胶体耗竭和滤泡细胞高度增加，这些变化在组织学上定性地观察到，与暴露于10 mU/mL TSH所引起的变化相似。这些改变与之前报道的体内研究结果一致，支持了所观察到的反应具有生理相关性。

3.4. 测试模型对甲状腺激素合成的抑制作用

T₄测量结果显示，与对照组相比，暴露于MMI的样品在第5-7天和第7-9天期间，T₄显著减少，这证实了MMI对甲状腺激素合成的抑制作用。这种效应在第3-5天未观察到，支持了滤泡T₄释放可能掩盖对新生合成抑制的观点。为了更准确地捕捉甲状腺激素系统干扰物的瞬时和持续效应，纵向采样（在不同时间点采样）显得至关重要。此外，作为细胞凋亡易感性指标的Bax/Bcl-2比值在不同MMI浓度下保持不变，表明MMI并未损害组织完整性，因此观察到的T₄下降是激素合成被抑制的结果。同时，钠碘转运体基因Slc5a5(NIS)在50和100 μM MMI下表达显著上调，而Tpo基因表达仅在100 μM时才增加。这可能是甲状腺对TPO抑制和激素合成受损的一种代偿性反应，试图通过局部反馈机制增加碘的摄取和激素产生。

本研究证明了通过监测培养基中T₄释放的变化，可以利用离体大鼠甲状腺模型检测由甲状腺过氧化物酶抑制引起的甲状腺激素干扰。通过整合功能性激素输出、组织学完整性和基因表达等终点指标，该模型为机制研究提供了一个平台。重要的是，研究确立了在长期培养中维持组织健康的关键参数。该模型对TSH刺激和MMI暴露均能产生可预测的响应，证实了其功能性反应能力。在动物研究中，暴露于MMI可引发显著的全身性甲状腺功能减退，低甲状腺激素水平会触发下丘脑释放促甲状腺激素释放激素，进而促使垂体释放更多的TSH。TSH水平的升高会通过TSH受体刺激甲状腺，激活基因转录、激素合成与分泌，以及甲状腺细胞增殖和肥大。这些变化反映了下丘脑-垂体-甲状腺轴内的内分泌反馈介导的系统性反应。相比之下，这项研究中的离体模型使用的是离体的甲状腺组织，因此观察到的效应源于化学物质与组织的直接相互作用，可能激活了甲状腺的旁分泌或自分泌调节。研究者发现的MMI诱导的组织学和基因表达变化，可能反映了对TPO抑制的代偿反应或MMI的直接效应。这种差异对于模型本身很重要，因为它表明观察到的变化反映了甲状腺固有的反应，而非系统性的内分泌反馈，从而允许对甲状腺内的局部过程和化学物质直接效应进行机制研究。离体甲状腺模型已被证明是介于简化的体外检测和复杂的体内研究之间的有价值中间步骤，能够更可靠地外推甲状腺激素干扰效应。未来，这个优化的离体模型可以整合到定量外推框架中，为预测毒理学提供支持。