《Nature Aging》：Simultaneous spatial transcriptomics and morphology profiling as tools to explore how microglia change with age
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这项研究结合多重误差稳健荧光原位杂交（MERFISH）与免疫荧光染色，在小鼠脑中同步解析了小胶质细胞的形态与亚细胞mRNA空间分布。研究发现，传统基于形态（阿米巴状 vs. 分支状）和转录组（稳态 vs. 疾病相关）的细胞状态分类存在错配，存在大量具有分支形态的疾病相关小胶质细胞（DAM）。研究进一步揭示了mRNA在胞体与突起中的特异性富集模式，并发现这种区室化特征及相关基因共定位网络会随衰老发生显著改变，为理解小胶质细胞在衰老与疾病中的功能调控提供了新视角。
研究方法与初步发现：MERFISH结合成像揭示小胶质细胞的转录状态与形态异质性
为了在空间原位解析基因表达与小胶质细胞形态，研究者对年轻（3月龄）和老年（24月龄）小鼠脑矢状切片应用了亚细胞分辨率的MERFISH技术，并结合离子钙结合衔接分子1（IBA1）的免疫荧光染色。通过对约4000个与IBA1分割形态精确对齐的小胶质细胞进行分析，研究揭示了三种主要的转录亚型：表达经典标记物P2ry12、Tmem119和Cx3cr1的稳态小胶质细胞；高表达Cd83和Hif1a的过渡态小胶质细胞；以及高表达疾病相关小胶质细胞（DAM）标记物如Itgax、Axl和Spp1的DAM样小胶质细胞。这些亚型的脑区分布存在差异，且DAM样细胞在老年鼠中比例增加。
在量化形态特征后，一个关键发现挑战了传统认知：尽管平均而言DAM样小胶质细胞表现出更接近阿米巴状的形态（如更高的细胞实心度），但该群体内部存在巨大的形态异质性。相反，稳态和过渡态小胶质细胞也展现出分支程度的显著差异。特别是，大约30%的DAM样细胞具有高度分支的形态，这与“激活状态等同阿米巴状形态”的经典假设相矛盾。通过免疫组化对AXL（DAM标记物）阳性细胞的验证，进一步确认了分支状DAM样细胞的存在。
基于形态的深度聚类与基因-形态关联分析
为了更细致地探究形态与功能的关系，研究者利用预训练的神经网络从IBA1图像中提取高维形态嵌入特征，并进行了无监督聚类。根据分支程度从低到高，小胶质细胞被分为C1至C5五个形态簇。分析显示，这些形态簇与转录簇并非一一对应。例如，在稳态小胶质细胞中，既存在高度分支的细胞，也存在阿米巴状的细胞；而在DAM样细胞中，也同时包含两种极端形态。这表明转录状态和形态是可以部分解耦的。
通过计算基因表达与多种形态特征之间的斯皮尔曼相关性，研究鉴定出一组与形态强相关的基因。例如，编码谷氨酸转运蛋白1（GLT-1）的基因Slc1a2和谷氨酸受体基因Gria2的表达与细胞分支程度呈正相关。单分子荧光原位杂交证实，这些转录本确实存在于IBA1阳性的小胶质细胞内，而非星形胶质细胞污染。这组形态关联基因能够有效地区分不同形态的细胞群。
亚细胞mRNA区室化及其对形态的预测能力
研究进一步将高分支形态的细胞（C4和C5）的胞体与突起区室进行分割，并分别计算转录本数量。结果发现，不同基因的mRNA表现出明显的区室化富集趋势。例如，稳态标记基因Cx3cr1、Csf1r的转录本更倾向于富集在胞体附近，而Apoe、Slc1a2等基因的转录本则在胞体和突起中分布得更为均匀。通过差异分析，最终在分支状细胞中鉴定出14个胞体富集基因和57个突起富集基因。基因本体分析显示，胞体富集基因与内吞囊泡等功能相关，而突起富集基因则与线粒体、细胞突起等结构相关。
重要的是，这些突起富集基因的表达模式与细胞形态密切相关。基于这组基因表达量训练的随机森林分类器，能够以较高的准确度区分分支状和阿米巴状的小胶质细胞，曲线下面积达到0.76。其中，Slc1a2和Pink1是分类器中最重要的特征基因，提示这些定位在突起的mRNA在塑造细胞形态中起着关键作用。
衰老对mRNA区室化及共定位网络的重塑
衰老显著影响了mRNA的区室化模式。在年轻小鼠的分支状小胶质细胞中，鉴定出16个胞体富集和50个突起富集基因；而在老年鼠中，这两个数字分别减少至8和23，表明衰老降低了mRNA的区室化程度。尽管富集基因的数量减少，但突起富集基因集在年轻和老年细胞中仍能有效预测形态，其预测能力在老年细胞中略有下降。
研究还利用Ripley‘s K分析和共定位网络构建，深入探究了衰老对亚细胞区域内mRNA空间组织的影响。分析发现，无论在胞体还是突起区室内，年轻细胞中具有显著共定位关系的基因对数量都远多于老年细胞。对衰老过程中发生改变的共定位基因网络进行功能分析，揭示了深刻的生物学意义转变。在年轻细胞的胞体内，共定位网络与细胞因子产生、代谢过程等功能相关；而老年细胞的胞体网络则转向与趋化性、突触修剪相关的功能。在突起区域，年轻细胞的网络与蛋白质定位、突触修剪相关，而老年细胞的网络则转变为与内吞作用、分解代谢过程调节相关。这些发现表明，衰老不仅改变了mRNA的定位，更重塑了其功能性的空间共定位网络，从而可能驱动小胶质细胞功能程序的转变。
总结与展望
本研究通过整合空间转录组学与形态学分析，首次在单细胞和亚细胞水平上系统描绘了小胶质细胞形态与mRNA空间组织的全景图。核心结论包括：1）传统上基于形态或转录组的单一分类框架不足以描述小胶质细胞的复杂状态，形态与转录组存在显著异质性和解耦现象；2）mRNA在胞体与突起中的特异性定位（区室化）是决定细胞形态的关键因素之一，一组突起富集基因能够预测细胞的复杂程度；3）衰老过程会削弱mRNA的区室化，并重塑其功能性的共定位网络，这可能构成了小胶质细胞在衰老过程中功能转变的结构基础。
这项工作挑战了关于小胶质细胞“激活”状态的固有范式，例如发现高表达谷氨酸转运蛋白Slc1a2（传统上被认为是“激活”标记）的细胞反而具有更分支的形态。这为理解神经退行性疾病中观察到的形态与功能异常提供了新的分子机制视角。未来，结合更高分辨率的空间组学技术、全转录组测量以及更精确的细胞分割方法，将进一步阐明亚细胞转录组空间组织如何调控细胞功能异质性，并为针对细胞结构和空间基因表达组织的治疗策略开发奠定基础。
