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本研究通过水解提取评估了立陶宛六个地区普通小檗（Berberis vulgarisL.）树皮、叶片和果实中总释放多酚(TPC)与抗氧化活性。结果表明，尽管不同组织间TPC均值差异不显著，但其抗氧化活性存在显著的测定方法(FRAP, CUPRAC, ABTS, DPPH)及地理来源依赖性。地理因素引起的变异甚至可能超过组织差异。研究强调，结合水解处理、多方法抗氧化评估与色谱(HPLC-DAD, LC-MS)分析，可更全面地评估小檗作为天然抗氧化剂来源的潜力，为食品应用中的标准化和质量控制提供科学依据。
1. 引言
植物多酚作为食品体系中的天然抗氧化剂备受关注，但抗氧化能力数据因测定方法化学和地理起源的不同而难以比较。常规溶剂提取评估可能低估不可提取酚类成分的贡献。普通小檗(Berberis vulgarisL.)的研究多聚焦于异喹啉生物碱小檗碱，而酚类化合物常被视为次要成分。然而，酚类化合物是水性体系和食品基质中抗氧化活性的主要贡献者。现有研究多集中于溶剂可提取的酚类，对总释放酚类（包括不可提取或结合形式）的关注相对有限。酚类在植物组织中的分布受生物合成调控、生理功能及环境适应的影响，因此，不同组织（叶、皮、果）是化学性质不同的基质，具有不同的酚类谱和抗氧化反应。此外，酚类的生物合成也受到光照、温度、土壤组成等环境因素的强烈影响。本研究旨在通过对立陶宛多个自然生境的普通小檗原材料进行多方法评估，重点关注通过顺序水解获得的总释放酚类（包括不可提取部分），并结合互补的分光光度法和色谱法，来评估其抗氧化能力和地理依赖性变异，为食品科学应用提供更全面的表征。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料、采样地与样品制备
研究材料为普通小檗(Berberis vulgarisL.)，采样自立陶宛的六个不同地点。为减少季节变异，树皮在早春（3月）采集，叶片在花期后（6月）采集，完全成熟的果实在秋季（10月）采集。材料在室温下避光风干，研磨后于4°C保存。
2.5. 小檗提取物的制备
为改善共轭酚类的回收率，样品经过顺序酸-碱水解处理，旨在释放简单溶剂提取下可能无法完全提取的酚类组分。离心后收集上清液，残渣再用70%甲醇提取三次。每个采样点的每个植物部位提取两次，共获得36份提取物。所有结果均基于干重(DW)表示。
2.6. 总酚含量(TPC)测定
采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量。使用没食子酸制作标准曲线，结果以每克干重没食子酸当量毫克数(mg GAE/g DW)表示。需注意该测定提供的是提取物总体还原能力的估计，并非完全特异于酚类化合物。
2.7. 抗氧化活性测定
抗氧化能力通过互补的测定法评估：FRAP（铁离子还原抗氧化能力）、CUPRAC（铜离子还原抗氧化能力）、ABTS和DPPH（自由基清除活性）。结果以每克干重Trolox当量微摩尔数(μmol TE/g DW)表示。DPPH测定中，树皮提取物的响应低于定量限(LOQ)，因此在后续分析中排除。
2.8. 酚类化合物的色谱分析
考虑到小檗果实作为食品基质的相关性以及观察到的抗氧化指标显著的地理依赖性变异，对果实提取物进行了HPLC-DAD和LC-MS定性色谱分析。HPLC-DAD作为初步筛选步骤，随后LC-MS用于确认性鉴定。该分析旨在定性表征果实提取物中的主要酚类化合物类别，以支持分光光度法结果，而非对单个化合物进行绝对定量。
2.9. 统计分析
数据使用Excel和SPSS处理。通过Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。采用单因素方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis检验进行组间比较。使用Spearman相关系数评估总酚含量与抗氧化活性之间的关联。所有分析结果均使用实验测定的干燥失重值归一化为干重。
3. 结果
3.1. 干燥失重
果实水分含量最高(9.8 ± 0.2%)，其次是叶片(7.6 ± 0.8%)，树皮最低(5.5 ± 0.9%)。所有样品均符合欧洲药典对草药的要求（水分不超过10%）。
3.2. 树皮、叶片和果实提取物的总酚含量
总酚含量(TPC)在不同植物部位间无显著差异。果实提取物均值最高(121.9 ± 14.7 mg GAE/g DW)，其次是叶片(111.9 ± 8.4 mg GAE/g DW)和树皮(108.7 ± 14.1 mg GAE/g DW)。叶片提取物的变异性最低，果实和树皮提取物变异性相当。
3.3. 总酚含量的地理变异
TPC因植物材料的地理来源而异。在树皮提取物中，TPC范围从88.3 ± 7.9 到 124.0 ± 9.7 mg GAE/g DW。叶片提取物TPC范围从81.1 ± 8.1 到 166.9 ± 7.9 mg GAE/g DW。果实提取物的TPC变异最广，范围从80.0 ± 5.1 到 242.2 ± 61.0 mg GAE/g DW，高低值相差约三倍。最高TPC出现在Jonava地区采集的果实中，最低出现在Anyk??iai地区的森林中。
3.4. 提取物的抗氧化活性
抗氧化活性通过FRAP、CUPRAC、ABTS和DPPH测定进行评估。
3.4.1. FRAP
树皮提取物显示出最高的平均还原能力(373.2 ± 15.9 μmol TE/g DW)，其次是叶片(305.7 ± 32.3 μmol TE/g DW)和果实(275.9 ± 26.7 μmol TE/g DW)。总体而言，Kaunas地区Girionys森林采集的样品倾向于表现出更高的FRAP值。
3.4.2. CUPRAC
叶片提取物显示出最高的平均CUPRAC活性(395.7 ± 46.7 μmol TE/g DW)，其次是果实(316.2 ± 32.5 μmol TE/g DW)，树皮最低(248.9 ± 24.5 μmol TE/g DW)。最高的CUPRAC活性也一致地出现在Kaunas地区Girionys森林的样品中。
3.4.3. ABTS
叶片提取物表现出最高的平均活性(346.6 ± 48.5 μmol TE/g DW)，其次是果实(292.4 ± 28.0 μmol TE/g DW)和树皮(244.6 ± 27.9 μmol TE/g DW)。最高的ABTS活性出现在Kaunas地区Girionys森林采集的叶片提取物中。
3.4.4. DPPH
DPPH自由基清除活性仅在叶片和果实提取物中测定。果实提取物平均活性(243.4 ± 56.6 μmol TE/g DW)高于叶片提取物(205.9 ± 84.9 μmol TE/g DW)。树皮提取物的DPPH吸光度值在所用分析条件下低于定量限，因此被排除在进一步分析之外。叶片提取物的DPPH活性在不同采样点间无显著差异，而果实提取物的DPPH活性则显示出显著的地理依赖性差异。
不同部位TPC和抗氧化测定响应的均值总结如下图热图所示：
3.5. 果实提取物中酚类化合物的定性分析
HPLC-DAD和LC-MS分析揭示了小檗果实提取物中结构多样的酚类组成。鉴定出的酚酸包括没食子酸、绿原酸、咖啡酸和丁香酸，代表羟基苯甲酸和羟基肉桂酸亚类。黄酮类部分包括黄烷-3-醇（儿茶素、原花青素B2）、黄酮苷（槲皮苷）和黄酮醇苷（芦丁），以及黄酮苷元槲皮素。部分化合物通过LC-MS确认，其他则基于HPLC-DAD保留行为和UV-Vis光谱特征进行暂定归属。
3.6. 总酚含量与抗氧化活性的相关性
Spearman相关分析揭示了TPC与抗氧化活性之间存在统计学上显著的正相关，相关强度因植物部位和测定方法而异。在树皮提取物中，TPC与FRAP、CUPRAC和ABTS呈强相关。在叶片提取物中，TPC与FRAP、CUPRAC和ABTS呈极强的正相关，但与DPPH的相关性较弱。在果实提取物中，观察到与FRAP、CUPRAC和ABTS呈中等相关，与DPPH呈弱相关。总体而言，这些结果表明，较高的总酚含量与较高的抗氧化活性相关，特别是在基于电子转移的测定中，而DPPH响应与TPC的关联较弱。
4. 讨论
4.1. 干燥失重与样品质量
小檗树皮、叶片和果实的干燥失重值均低于欧洲药典规定的10%上限，表明干燥条件适宜，植物材料适合进行定量植物化学分析。
4.2. 不同植物部位的总酚含量
本研究表明，小檗不同植物部位的总酚含量存在差异，果实倾向于表现出更高的平均TPC，其次是叶片和树皮。尽管跨地点平均后，不同部位间的差异不显著，但观察到因地理来源而产生的巨大变异。果实TPC较高的趋势与其作为富含酚酸、黄酮类化合物和原花青素的保护组织的生物学作用一致。然而，已报道的小檗器官水平趋势因研究而异，绝对TPC值因提取策略和表达基础的不同而有很大差异，这使得跨研究直接比较变得复杂。本研究应用的顺序酸-碱水解旨在在标准化分析条件下评估总释放酚类。在许多植物基质中，相当一部分酚类化合物以与细胞壁结构组分相关的共轭或不溶性结合形式存在。水解处理能够释放这些不可提取的组分，可能导致与单独溶剂提取相比更高的TPC值。因此，此处报告的数值反映了总释放酚类，而非完整的原生酚类谱，跨研究比较应结合方法学谨慎解读。
4.3. 地理起源对酚类含量的影响
在所有植物部位中均观察到采样点之间TPC的显著差异，其中果实的变异最为显著。Kaunas和Jonava地区采集的果实TPC值明显高于立陶宛其他地区。这两个地区地理位置相近，这表明即使相对小范围的环境异质性也可能显著影响酚类的积累。环境因素如温度、太阳辐射、土壤成分和水分有效性，通过调节苯丙素途径来调控酚类的生物合成。因此，累积的当地环境影响可能改变酚酸、黄酮类及相关化合物的合成和相对丰度，导致TPC值的可测量变化。本研究观察到的地理依赖性变异的程度与近期研究中报道的不同来源之间的差异一致。本研究将标准化的水解方案和统一的分析框架应用于所有采样点，使得地理依赖性差异能够在受控的方法学背景下得到解读。本研究数据将酚类表征的地理范围扩展到了北欧种群，该种群在当前文献中代表性相对不足。
4.4. 基于电子转移测定的抗氧化活性评估
通过FRAP、CUPRAC和ABTS测定确定的抗氧化活性揭示了植物部位和采样点之间的明显差异。树皮提取物在FRAP测定中表现出最高的还原能力，而叶片在CUPRAC和ABTS测定中表现出最高的活性。这种差异反映了这些测定方法潜在反应机制的差异以及主要抗氧化化合物的化学性质。FRAP对酸性条件下能还原三价铁离子的化合物（如酚酸和缩合单宁）特别敏感，这些化合物通常与树皮组织相关。相比之下，CUPRAC和ABTS测定在接近中性的pH下进行，对更广泛的黄酮类化合物和酚苷响应更好，这些物质在叶片中含量丰富。近期文献进一步说明了小檗基于电子转移的抗氧化值因提取策略和报告格式而呈现的显著变异性。重要的是，尽管基于水解的方案有时被认为会显著提高抗氧化估计值，但在近期溶剂提取研究的背景下评估本研究结果发现，无论提取策略如何，小檗的抗氧化值在整个文献中仍然高度分散。这些观察结果表明，研究间的变异不能仅归因于结合酚类的水解释放，而是反映了植物来源、基质组成、分析条件和表达基础的共同影响。
4.5. 自由基清除活性与方法依赖性差异
DPPH自由基清除活性仅在叶片和果实提取物中检测到，而树皮提取物在所用分析条件下的值低于定量限。这一观察结果反映了测定灵敏度和基质依赖性响应特征，而非缺乏自由基清除化合物。与叶片和果实相比，树皮基质可能含有更高比例的结构复杂或聚合的酚类成分，这些成分在DPPH体系中可能表现出较低的溶解度和较慢的反应动力学。因此，低于定量限的值被解释为反映了所用分析条件下测定和基质依赖性的限制，而非组成上的缺失。近期基于溶剂的研究进一步说明了小檗DPPH结果的变异性。由于这些研究完全依赖溶剂提取而没有水解释放结合酚类，不可提取组分对自由基清除能力的贡献可能未得到充分体现。本研究采用的以总释放酚类为目标的水解方法，为在结构更广泛的酚类框架内解读DPPH活性提供了补充视角。
4.6. 酚类谱及其与抗氧化测定响应的关系
对小檗果实提取物的定性色谱分析揭示了结构多样的酚类组成。同时，在水解后测定的总释放酚类含量与通过FRAP、CUPRAC和ABTS测定测得的抗氧化活性之间观察到统计学上显著的正相关。在树皮和果实中，Spearman系数在0.51到0.82之间，在叶片中达到特别高的值(0.90–0.95)，而与DPPH的相关性则 consistently较弱(0.33–0.35)。通过LC-MS鉴定的结构类别为这些测定依赖性关系提供了机制上的合理性。电化学研究表明，酚酸的氧化还原行为受羟基取代模式和共轭作用的强烈影响。在芳香环中引入额外的羟基可降低氧化电位并增强给电子能力。特别是具有儿茶酚部分的羟基肉桂酸（如咖啡酸和绿原酸）由于芳香环和共轭侧链上的π电子离域而表现出改善的氧化还原性能。黄酮类化合物的构效关系进一步支持了这一解释。B环中邻二羟基（儿茶酚）结构的存在，加上C环中C2=C3共轭和4-羰基，增强了自由基稳定性和电子离域。槲皮素满足这些结构标准，通常比其糖基化衍生物表现出更高的抗氧化活性。3位的糖基化可能降低平面性和电子离域，从而调节测定响应性。因此，本研究提取物中槲皮素（苷元）、芦丁和槲皮苷的共存反映了一个结构异质的黄酮类组分，在不同测定中可能有不同的贡献。不同抗氧化测定之间的差异可以根据其不同的反应机制来理解。基于电子转移的测定(FRAP, CUPRAC, ABTS)在pH和氧化剂氧化还原电位上有所不同。FRAP在酸性条件下运行，优先检测具有足够低氧化电位的化合物，而在接近中性pH下进行的CUPRAC和ABTS则对更广泛的酚类化合物有响应。相比之下，DPPH反应性可能更多地受到空间可及性、溶解度和反应动力学的影响，导致酚酸和黄酮类化合物之间的结构依赖性变异。这种机制上的区别与本研究观察到的相对较弱的总酚含量与DPPH相关性是一致的。
4.7. 小檗作为天然抗氧化剂来源的应用意义
综上所述，结果表明小檗果实和叶片是天然抗氧化剂的有前景来源，其酚类含量和抗氧化活性受地理起源的影响。结合使用互补的抗氧化测定和色谱分析，提供了对抗氧化潜力的全面评估，这对于为食品、营养保健品或制药应用合理选择植物材料至关重要。需要承认一些局限性。首先，Folin-Ciocalteu测定提供的是总体还原能力的估计，并非完全特异于酚类化合物；因此，非酚类还原剂（如抗坏血酸和其他基质成分）可能对报告的“总酚含量”值有贡献，应结合互补的抗氧化测定和色谱证据进行解读。其次，采样在一个生长季节内进行，未明确区分地点内的环境效应和遗传效应。最后，由于立陶宛是一个在小檗植物化学方面研究相对较少的北欧地区，这些数据有助于填补地理空白，但更广泛的多年度采样将加强普适性，并有助于为实际应用选择原材料。在所用测定和采样设计的局限性范围内，叶片和果实成为抗氧化评估的特别相关基质。在酚类丰富的植物提取物中，已报道了类似的方法和基质依赖性的、介于总酚估计和自由基清除读数之间的差异，这强调单一测定报告可能会错误地反映实际抗氧化性能。此外，基于生化成分和HPLC图谱对小檗基因型的多变量分析突出了因植物来源引起的显著变异，支持了在解释抗氧化潜力时需要考虑地理和遗传因素。
5. 结论
尽管跨地点平均后，不同植物部位间的总酚含量(TPC)无显著差异，但观察到了显著的地理依赖性变异，特别是在果实中，其TPC范围相差约三倍。重要的是，使用水解法评估总释放酚类表明，先前报告的溶剂可提取值可能低估了该物种中对抗氧化能力有贡献的酚类库。虽然本研究未单独定量可提取和结合酚类组分，但所应用的水解方案能够更全面地评估可能对抗氧化行为有贡献的总酚类库。水解扩大了酚类库，但并未机械地将抗氧化结果提高到超出基于溶剂研究的报告范围。此外，总释放酚类与基于电子转移的测定(FRAP, CUPRAC, ABTS)之间存在统计学上显著的秩相关，支持了在所用分析框架内，这种更广泛的酚类库与测量的抗氧化响应的相关性。抗氧化响应具有强烈的测定方法依赖性。树皮表现出最高的铁还原能力(FRAP)，而叶片显示出最高的CUPRAC和ABTS活性，DPPH响应仅在叶片和果实提取物中可测量。这些发现证实，小檗的抗氧化能力不能解释为单一的内在属性，而是反映了酚类结构、反应机制和分析条件之间的相互作用。将互补的分光光度法与色谱分析(HPLC-DAD和LC-MS)相结合，能够根据已鉴定的酚类类别解读测定差异，从而超越总酚报告，转向结构信息化的抗氧化评估。鉴于色谱分析的定性范围，结构-测定关系在酚类类别层面进行解读，因此应被视为机制上合理，而非定量解析。从更广泛的角度来看，结果强调了未来研究和应用的两个重要考虑因素：(i) 在跨研究比较抗氧化数据时，需要区分溶剂可提取酚类组分和总释放酚类组分；(ii) 地理背景在原材料选择和标准化中的重要性。此外，观察到的地理依赖性变异强调了环境因素对酚类丰度和测定响应性的潜在影响。通过将小檗的酚类表征扩展到北欧种群，并在多测定框架内整合不可提取组分，本研究有助于更全面地理解这种被广泛研究但方法学上异质的物种的抗氧化行为。
