《Antioxidants》：Oxidative Stress Signaling and Regenerative Responses in a Larval Zebrafish Model of Retinal Light Damage
Ignacio Babiloni-Chust,
Luigi Donato,
Samuele Sartori,
Matthias Carl,
Darin Zerti,
Carmela Rinaldi,
Vincenzo Flati,
Marco Feligioni,
Rosalia D’Angelo and
Lucia Poggi
+ 1 author
斑马鱼幼虫光损伤视网膜模型中氧化应激信号与再生反应的整合研究
摘要
斑马鱼因其强大的视网膜再生能力，成为研究神经修复机制的理想模型。在成鱼中，光诱导视网膜损伤（LIRD）是一种常用的环境光毒性应激源，可诱导光感受器变性和再生反应，但幼虫模型的研究相对不足。本研究验证了一种幼虫LIRD模型，将其作为一个研究急性光毒性损伤和早期再生相关转录组反应的多功能系统。通过高通量RNA测序，研究人员分析了LIRD后48小时视网膜的转录组变化，并辅以针对氧化还原信号的特异性药物调节。幼虫LIRD诱导了经典凋亡和再生相关通路的强烈激活，重现了成鱼LIRD模型的关键特征，同时涉及了先前未被充分探索的基因调控网络。其中，与氧化应激反应、抗氧化酶和氧代谢相关的通路被显著调控。使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）减弱氧化应激，可减少光毒性损伤诱导的细胞凋亡和增殖，而炎症标志物则基本不受影响。相反，视网膜内亚毒性过氧化氢（H2O2）暴露足以在不引发凋亡反应的情况下诱导增殖标志物。在信号水平上，氧化应激的调节影响了早期损伤反应期间被激活的生长相关信号通路的组分。这些发现共同支持了氧化应激作为幼虫视网膜再生早期损伤相关信号关键组成部分的作用。本研究整合了组织学、转录组学和药理学分析，以探究早期再生程序，并为探索视网膜损伤和修复中氧化还原相关机制提供了全面的转录组资源。
引言
斑马鱼视网膜具有哺乳动物所缺乏的再生能力，使其成为研究成功神经修复机制的有力系统。损伤后，视网膜中的主要胶质细胞——米勒胶质细胞（MG）会重新进入细胞周期，去分化为祖细胞样状态，并产生能够分化为所有主要视网膜神经元类型的多能祖细胞。常用的损伤范式之一是光诱导视网膜损伤（LIRD），其中光感受器由于过量的光氧化应激而迅速退化。基于此，大量研究已经确定了驱动MG重编程和神经元再生的分子程序，突出了炎症信号、染色质重塑和转录调控之间的协调相互作用。虽然炎症通路在此背景下已被广泛表征和功能研究，但相比之下，对氧化应激相关信号在介导光感受器损伤之外的贡献定义关注较少。跨物种的单细胞和整体转录组比较进一步描绘了斑马鱼、鸡和小鼠视网膜中MG激活的保守和不同方面，特别是在成体损伤模型中。然而，尽管损伤后48-72小时内发生的最早分子事件在建立促再生转录景观中起着至关重要的作用，但它们仍未被充分表征。
斑马鱼幼虫为剖析此类早期反应提供了独特的优势。其光学透明性、快速发育、体型小以及与高通量成像、测序和药物筛选的兼容性，使得能够系统地在体内研究急性分子动力学。虽然LIRD已广泛用于成年斑马鱼以研究光感受器损伤和MG激活，但较少有研究检查幼虫阶段，并且缺乏对幼虫转录变化的全面表征。这一空白限制了幼虫LIRD作为再生生物学可扩展发现平台的采用。
在本研究中，研究人员对受精后4天（4 dpf）的色素斑马鱼幼虫进行了LIRD，并使用多模式实验方法分析了损伤后48小时的视网膜反应。通过结合组织学分析、免疫组织化学、转录组学和靶向药物干预，研究人员定义了光毒性损伤后的急性细胞和分子景观。除了经典参与者外，还发现了几条未被充分探索的损伤相关通路的协调调控。值得注意的是，氧化应激和活性氧（ROS）相关基因网络被显著调控，强化了它们作为急性损伤反应中必需介质的作用。
ROS的作用在不同的发育和再生背景中已被强调。然而，它们对斑马鱼视网膜再生的功能贡献，尤其仍未得到充分定义。为了探索氧化应激对幼虫LIRD诱导改变的贡献，研究人员将受控的过氧化氢（H2O2）暴露与使用已知ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）的药物氧化还原调节相结合。NAC减弱了凋亡信号并抑制了MG增殖，而未显著改变炎症基因表达，而亚毒性H2O2在缺乏凋亡的情况下增强了增殖。这些发现共同表明，ROS在早期MG激活和再生启动中起到调节信号的作用，并强调了幼虫LIRD系统在体内通路研究中的药物可操作性。
材料与方法
斑马鱼饲养、LIRD范式和NAC处理
所有斑马鱼操作均根据特伦托大学的机构指南进行，并得到意大利卫生部批准。野生型TU和Tg(fli:gal4;UAS:mCherry)斑马鱼在标准实验室条件下于28°C、14:10小时光/暗循环中维持。胚胎收集在培养皿中，并在黑暗中于28°C的1× E3培养基中孵育。
对于光诱导视网膜损伤（LIRD）范式，在4 dpf时将50个胚胎一组转移到含有不含亚甲基蓝的1× E3培养基的烧杯中。烧杯用铝箔覆盖以增强光反射，并暴露于强光（50,000 勒克斯）下3.5小时。使用配备双臂光纤卤素光源的立体显微镜系统同时从上方和下方进行照明。在整个暴露过程中持续监测温度并维持在28°C。LIRD后，胚胎被放回黑暗条件下恢复。在LIRD后48小时，用三卡因麻醉胚胎，并在立体显微镜下解剖视网膜用于下游分析。
选择单一浓度的NAC（100 μM）作为非致畸剂量，该剂量可有效调节抗氧化防御，这是基于已建立的斑马鱼方案和初步毒性试验确定的。在此浓度下，未观察到幼虫形态、心率或运动活动的显著改变。每次实验新鲜配制NAC溶液于1× E3培养基中，并将pH调至7.4以防止酸性应激。LIRD后立即将50个胚胎一组转移到含有补充了100 μM NAC的E3的培养皿中，并在黑暗条件下恢复。48小时后，收集视网膜并进行蛋白质印迹（WB）或实时定量PCR（RT-qPCR）分析。
免疫组织化学（IHC）、图像采集
幼虫在4°C下用4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定过夜并轻轻摇动。为了进行冷冻保护，将样品浸入30%蔗糖中于4°C过夜，包埋在FSC 22冷冻切片介质中，并使用Leica CM 1850 UV冷冻切片机以15 μm厚度切片。将切片收集在Superfrost Ultra Plus载玻片上。为了最大限度地减少非特异性结合，将切片在封闭缓冲液中于室温下孵育至少一小时。一抗用封闭缓冲液稀释，并在4°C下孵育过夜。用PBST洗涤三次后，在封闭缓冲液中应用二抗，于室温孵育一小时。对于PCNA免疫染色，在封闭步骤之前，通过在10 mM柠檬酸钠（pH 6.0）和0.01% Tween-20中煮沸载玻片20分钟来进行热诱导抗原修复。使用含DAPI的VECTASHIELD抗淬灭封片剂封片，并在成像前固化48小时。共聚焦显微镜成像在Leica SP8系统上进行，使用HC PL APO 63×/1.30 Oil CS2物镜。以2048 × 2048像素的分辨率（速度：200 Hz，步长：1 μm）采集图像，z轴堆栈覆盖整个视网膜厚度。对于Caspase-3（Casp3）成像，使用配备20×物镜的Zeiss Axio Imager M2显微镜。使用Fiji进行图像处理和定量测量。为了评估光感受器区室的结构完整性，在Zpr1/DAPI染色的冷冻切片上进行了形态计量学分析。
形态计量学分析和定量
光感受器细胞层（PCL）厚度定义为从DAPI染色细胞核的最基底侧（突触蒂明显可见）到Zpr1阳性信号最顶端边缘的纵向距离。为了确保数据的稳健性，对每个样本的三个不同共聚焦平面（z切面）的测量值取平均，每个平面在等距处进行三次独立测量。所得算术平均值作为每个生物学重复的代表值。
H2O2视网膜内注射
为了诱导ROS，在4 dpf时用MS222麻醉幼虫，并将其背侧定位，一侧置于载玻片边缘。使用连接到显微注射器的玻璃毛细管，将3 nL的100 μM H2O2溶液注射到每个视网膜中。使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为载体对照。注射后，将幼虫在28°C的黑暗条件下于培养皿和E3胚胎培养基中恢复。注射后48小时，收集视网膜并进行蛋白质印迹或RT-qPCR分析。
蛋白质印迹
收集50个视网膜的池，用冷PBS洗涤，并在Laemmli裂解缓冲液中裂解。蛋白质提取物在8–16% Mini-PROTEAN TGX预制胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上。膜在室温下用5%脱脂牛奶或5% BSA封闭1小时，然后在4°C下与一抗孵育过夜。
在TBST中洗涤三次后，将膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育1小时。使用SuperSignal West Femto化学发光底物进行信号检测，并在Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系统上采集。使用Image Lab软件进行光密度分析。
RNA提取、质量控制和RT-qPCR
使用TRIzol试剂按照制造商的说明提取总RNA。将RNA沉淀重悬于无RNase水中，并使用Qubit RNA HS检测试剂盒进行定量。使用Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA完整性；使用RNA 6000 Nano Chips。仅使用RNA完整性数≥ 7且OD260/280比值在1.9和2.1之间的样品进行下游分析。
使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和随机六聚体引物进行逆转录。在CFX96实时PCR检测系统上使用iTaq Universal SYBR Green Supermix进行实时定量PCR，反应体积为10 μL，遵循制造商的说明。
使用CFX Manager软件分析数据，并使用2?ΔΔCt方法表示为相对基因表达水平，归一化至对照样品。使用看家基因ube2a进行归一化。所有反应均进行技术性三重重复。
文库制备和RNA测序
使用oligo-dT磁珠从总RNA中分离poly(A)+ mRNA。使用Watchmaker RNA Library Prep Kit按照制造商的说明制备链特异性测序文库，包括第一链和第二链cDNA合成、末端修复、接头连接以及用于样品多路复用的独特双索引的掺入。
使用Fragment Analyzer系统评估最终文库的浓度、质量和插入片段大小分布。将等摩尔的索引文库池在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序，每个样品平均深度约为8000万条读长。
初级生物信息学分析：读长处理和比对
使用FastQC对原始FASTQ文件进行初步质量控制。使用Trimmomatic去除接头序列和低质量碱基。使用STAR aligner将高质量读长比对到斑马鱼参考基因组，并启用双程比对以提高剪接连接点检测。
基因定量和差异表达分析
使用两种互补的方法对已比对的读长进行定量：使用featureCounts进行外显子水平汇总和链特异性计数；使用CLC Genomics Workbench评估整体比对效率、以每百万转录本数（TPM）表示的转录本水平丰度、融合事件以及通过其RNA-Seq分析模块评估转录本多样性。
将featureCounts生成的原始计数矩阵导入R，使用DESeq2进行差异表达分析。绝对log2倍数变化 > 0.585且Benjamini–Hochberg校正p值（错误发现率，FDR）< 0.05的基因被认为是显著差异表达的基因。
通过检查离散度估计、MA图和主成分分析（PCA）来评估模型性能和数据质量。PCA被用作探索性质量控制步骤，基于全局基因表达谱评估样本间变异性。行为表现为多变量异常值且未能与其生物学重复聚类的样本被排除在下游分析之外。仅通过质量控制的样本被保留用于PCA可视化和差异表达分析。
功能注释和通路富集分析
使用多个独立工具对DEG进行功能富集分析，以确保富集项的稳健性和交叉验证，包括g:Profiler、Enrichr、DAVID Bioinformatics Resources 2023和ReactomePA。
分析基因本体（GO）类别，包括生物过程、分子功能和细胞组分。保留至少由两个独立工具识别且校正p值 < 0.05的通路用于解释。在已建立的斑马鱼视网膜再生文献背景下评估经典再生相关通路（例如Jak/Stat、Notch、Wnt），而较少特征的通路则与PubMed和ZFIN交叉参考以评估先前的生物学注释。
转录本水平分析和异构体动力学
使用StringTie2通过参考引导的转录本组装评估转录本丰度和可变剪接。同时，使用CLC Genomics Workbench可视化外显子使用、转录本结构和跨条件的潜在融合事件。
使用DEXSeq框架评估差异转录本使用，从而能够在再生相关基因（包括sox2、ascl1a和stat3）中识别异构体水平的调控。
数据可视化和统计分析
在R中使用ggplot2、ComplexHeatmap、EnhancedVolcano、clusterProfiler和GOplot等包进行数据可视化。热图和火山图在对比中标准化。使用Cytoscape和ClueGO插件生成通路相互作用网络。所有原始和处理后的RNA-seq数据已存入NCBI基因表达综合数据库，登录号为GSE313277。
对于非转录组学分析，使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。使用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性。参数数据使用Student t检验进行分析，而非参数数据则使用Mann–Whitney检验进行分析，如相应图例所述。数据以平均值±标准差表示，统计显著性定义为p ≤ 0.05。示意图在biorender.com创建。
结果
光诱导视网膜损伤在斑马鱼幼虫中引发早期变性和再生相关反应
在4 dpf的色素幼虫中，通过暴露于高强度白光（50,000 勒克斯，持续3.5小时）诱导光诱导视网膜损伤（LIRD）。然后使用免疫组织化学、蛋白质印迹分析和转录组分析，在光损伤后48小时评估与早期变性和再生相关反应的细胞和分子特征。
为了评估LIRD后的光感受器完整性，研究人员对红色/绿色双锥光感受器标记物Arrestin 3a（Arr3a/Zpr1）进行了免疫荧光染色。在对照视网膜中，光感受器细胞核形成规则间隔且有组织的层，Zpr1标记定义了从突触蒂到顶端内段的连续区域。相比之下，经LIRD处理的视网膜表现出显著的光感受器形态异常，细胞核显得紊乱且比对照更密集。这与Zpr1阳性区域顶端-基底厚度的显著减少同时发生，表明光感受器区室的结构塌陷。这些变化与视网膜应激反应的急性早期阶段一致。
为了评估中央视网膜的早期增殖相关反应，研究人员检查了增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。为了特异性识别增殖的MG，使用了转基因报告品系Tg(fli1:gal4;UAS:mCherry)。该报告品系的验证证实，6 dpf幼虫中央视网膜中78.2 ± 8%的谷氨酰胺合成酶（GS）阳性MG共表达mCherry。除了分子标记外，这些mCherry阳性细胞表现出MG的标志性双极形态，具有向光感受器层延伸的顶端突起和内界膜处的基底端足。这种高度的重叠和形态一致性支持了该报告品系用于识别幼虫斑马鱼视网膜中MG群体的可靠性。
在6 dpf的生理条件下，除了少数分裂的晚期前体细胞外，中央视网膜基本没有PCNA表达。一致地，对照幼虫中的mCherry阳性MG很少表达PCNA。LIRD后，研究人员在mCherry阳性MG群体中观察到PCNA的强烈诱导，这与损伤诱导的细胞周期重新进入一致，且在分化标记物丢失之前。这些发现表明，LIRD触发了MG的反应性增殖，与其在再生过程中作为内源性视网膜干细胞的作用一致。
蛋白质印迹分析进一步证实了与LIRD诱导损伤相关的分子反应。与对照相比，裂解的caspase-3水平显著升高（约1.5倍），这与caspase-3免疫标记的增加一致，并反映了caspase依赖性凋亡通路的激活，与先前在光毒性视网膜损伤模型中的报告一致。同时，蛋白质印迹分析显示，LIRD后GFAP（约2.4倍）和PCNA（约1.5倍）蛋白水平显著上调，这与损伤视网膜中整体MG激活和增殖活性增加一致，与PCNA免疫组织化学显示的MG特异性增殖结果相符。
总之，这些结果表明，LIRD在斑马鱼幼虫视网膜中诱导了协调的凋亡、胶质细胞活化和增殖反应，重现了在已建立的成体视网膜损伤模型中观察到的标志性反应。
转录组分析描绘了经典再生程序以及未被充分探索的代谢和氧化还原应激反应
为了评估损伤相关的转录变化，对在光损伤后48小时收集的对照和LIRD视网膜进行了批量RNA测序。该分析揭示了对光毒性损伤的稳健且可重复的差异转录组反应。与先前描述的视网膜损伤和MG重编程的分子特征一致，差异表达分析鉴定出经典再生相关基因的上调，包括ascl1a、stat3和sox2。
基于基因本体（GO）和KEGG通路注释的功能富集分析强调了先前与MG激活和祖细胞增殖相关的信号通路的显著调控，包括Notch、Wnt、JAK/STAT和Hedgehog信号通路。除了基因水平的变化外，转录本水平的定量揭示了选定再生相关转录本的异构体特异性调控，包括ascl1a-201、stat3-202和sox2-201，表明光毒性损伤伴随着细微的转录调控。
除了经典再生相关通路外，功能富集分析还鉴定了几种在斑马鱼视网膜损伤和再生背景下较少讨论的生物过程。这些包括蛋白质水解、光转导重塑、激素介导的信号传导、氧转运和氧化应激反应。对选定差异表达基因（cpa1、hbae3、nos2a）的RT-qPCR验证证实了RNA-seq推导的表达趋势的方向性。
蛋白质水解成为最显著富集的生物学类别之一。与蛋白水解系统和翻译后调控相关的基因显示出上调和下调，表明光毒性损伤后蛋白稳态通路的协调重组。与光转导重塑相关的过程也显著富集，这可能表明光感受器应激后的适应性或代偿性转录反应。激素介导的信号通路同样富集，主要由Rev-erb核受体的协调下调驱动。出乎意料的是，编码血红蛋白亚基（hbbe1.3、hbae3、hbbe1.2和hbae1.3）的基因是氧转运类别中上调最强烈的转录本之一。虽然血红蛋白通常与红细胞相关，但越来越多的证据支持血红蛋白在非造血组织（包括大脑）中在氧化还原缓冲和一氧化氮信号传导中的非经典作用。与此观察结果一致，对氧化应激的反应显著富集，包括多种抗氧化和氧化还原调节基因的表达增加，包括prdx1、sod1、sod2、gprx4a、gprx4b。总之，急性LIRD启动了广泛的转录应激反应程序，超越了经典的再生相关通路。
氧化应激影响再生相关反应
幼虫LIRD后观察到的氧化应激和抗氧化相关基因网络（包括解毒酶和血红蛋白相关基因）的稳健转录调控，促使研究人员在功能上探究氧化应激对光毒性损伤后早期再生相关反应的贡献。
为此，在LIRD后，让幼虫在抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）存在下恢复48小时。RT-qPCR分析证实，氧化应激反应基因sod1的表达在LIRD后强烈诱导，并且这种诱导被NAC处理显著减弱，这与该条件下氧化应激的有效调节一致。类似地，促凋亡基因bax的表达在LIRD后升高，并在NAC处理的幼虫中显著降低，表明凋亡相关信号受到抑制。相比之下，炎症标志物il1β的表达在LIRD后仍然升高，且未被NAC处理降低，这表明在该范式中，炎症激活在很大程度上独立于抗氧化剂介导的氧化应激调节而维持。
接下来，研究人员检查了与早期再生相关反应相关的标志物。LIRD诱导了gfap表达的显著增加，而NAC处理减弱了这种增加。同时，与单独的LIRD相比，增殖相关标志物pcna的表达在NAC处理的幼虫中显著降低。这些数据共同表明，氧化应激有助于光毒性损伤后早期胶质细胞激活和增殖相关转录反应的诱导或维持。
为了在蛋白质水平验证抗氧化剂处理的转录效应，研究人员对在LIRD后48小时在存在或不存在N-乙酰半胱氨酸（NAC）的情况下收集的幼虫视网膜进行了蛋白质印迹分析。与光毒性损伤后凋亡相关通路的诱导一致，LIRD导致裂解的caspase-3蛋白水平显著增加，而NAC处理显著减弱了这种增加。同时，LIRD诱导的增殖细胞核抗原（PCNA）升高在NAC处理的幼虫中降低，表明在抗氧化条件下，增殖相关反应受到抑制。
关键的生长和再生相关信号组分，包括Hippo和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，在我们的转录组分析中富集，并且先前已被证明与视网膜损伤和再生有关。因此，研究人员检查了氧化应激的缓解是否影响这些通路。LIRD暴露与磷酸化ERK（pERK）水平的增加和磷酸化YAP（pYAP）水平的降低相关，这与MAPK和Hippo相关信号的调节一致。这两种反应均被NAC处理显著减弱。这些数据共同表明，NAC处理调节了LIRD诱导的凋亡和生长相关信号反应。
亚毒性H2O2暴露在没有明显凋亡的情况下促进增殖
鉴于在LIRD后抗氧化剂处理观察到的增殖相关反应减少，研究人员接下来询问，适度增加ROS水平是否足以在缺乏光毒性损伤的情况下影响增殖相关标志物。为了解决这个问题，在4 dpf幼虫中进行了载体（PBS）或过氧化氢（H2O2）的亚毒性视网膜内注射，然后让它们在标准条件下恢复48小时。
RT-qPCR分析显示，与PBS对照相比，H2O2注射后，促凋亡基因bax的表达没有显著改变
