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本综述探讨了γδ T细胞作为下一代“即用型”同种异体细胞疗法在癌症治疗中的巨大潜力。文章系统论述了其相对于传统αβ CAR-T细胞的优势（如无移植物抗宿主病风险、固有抗肿瘤活性），重点分析了Vδ1、Vδ2等主要亚群的特性和扩增方法，并详细介绍了为γδ T细胞量身定制的多种先进基因工程策略（如细胞因子装甲、非信号传导CAR、优势负性受体等），旨在克服实体瘤治疗中的障碍，为下一代细胞免疫疗法指明了方向。
利用先进制造和基因工程技术对γδ T细胞进行重编程用于癌症免疫治疗
引言
使用自体αβ T细胞的过继性免疫疗法在治疗多种癌症类型中已取得显著成功，其中嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的出现具有里程碑意义。然而，自体CAR-T细胞疗法可扩展性差，且在实体瘤中疗效有限。因此，寻找可填补这些空白的替代策略引起了广泛兴趣。γδ T细胞是一个有吸引力的选择，因为它们具有固有的抗肿瘤活性，并且在作为同种异体药物产品使用时不会引发移植物抗宿主病（GvHD）。
γδ T细胞亚群
人类主要有三种γδ T细胞亚型，其特征在于表达Vδ1、Vδ2或Vδ3 TCR亚基。
Vδ2细胞是外周血中的主要循环亚型，约占成人外周血单个核细胞中所有T细胞的1-5%，其中高达95%为Vδ2亚型。它们被甲羟戊酸途径的磷酸化抗原（pAg）中间体激活，该途径在恶性细胞中通量增加，使Vδ2细胞成为转化关键标志的内在监视系统。其识别通过BTN2A1-BTN3A1-BTN3A2嗜乳脂蛋白家族复合物介导。
相比之下，Vδ1 T细胞主要存在于皮肤、粘膜或皮下组织、肠上皮、肺、生殖器官、肝脏和脾脏等组织中，具有高度的组织向性。在一些实体瘤类型中，肿瘤浸润性Vδ1（而非Vδ2）细胞的存在与改善的预后相关。Vδ1 TCR的配体尚未完全明确，但有些显示出对CD1家族成员或MR1的限制性。
Vδ3细胞在外周循环中罕见，主要定位于胃肠道和肝脏。它们与Vδ1细胞识别相似的配体，并且同样表达CD16以介导抗体依赖性细胞毒性。
γδ T细胞的扩增方法
Vδ2 T细胞的扩增：通常使用合成磷酸化抗原（如溴氢化焦磷酸，BrHPP）或氨基双膦酸盐药物（如唑来膦酸，ZOL）联合白细胞介素-2（IL-2）来扩增外周血单个核细胞来源的Vδ2细胞，纯度可超过90%。然而，这种方法可能导致Vδ2细胞耗竭和激活诱导的细胞死亡（AICD）。使用BTN3A1激动性单克隆抗体或转化生长因子-β（TGF-β）进行扩增是新兴的优化策略，后者扩增出的“T2细胞”表现出增强的抗肿瘤活性和对免疫抑制的抵抗力。
Vδ1 T细胞扩增：临床级扩增方案（如“DOT细胞”协议）涉及两步磁珠分选，随后在包含IL-21、IL-1β、IL-4、干扰素-γ和抗CD3单克隆抗体OKT3的细胞因子混合物中培养。此类扩增的DOT细胞群体高表达自然杀伤细胞相关的细胞毒性受体。
通用扩增策略：使用人工抗原呈递细胞（aAPC），通常是经过基因工程改造的K562细胞系，共表达共刺激分子（如4-1BBL、CD86）和膜结合细胞因子（如mbIL-15），可高效扩增γδ T细胞，并兼容CAR转导。此外，使用抗Vδ1或Vδ2抗体加可溶性抗CD28进行抗体基扩增，也是一种无需饲养细胞的可行方法。
规模化与自动化制造平台：为了实现“即用型”同种异体疗法，可扩展、自动化的制造平台至关重要。诸如Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy?、Lonza Cocoon?和G-Rex?培养系统等平台已被探索或适用于γδ T细胞的规模化生产，以减少批次差异和操作依赖性。
γδ T细胞的新型基因工程策略
传统为αβ T细胞优化的CAR设计可能在γδ T细胞中引起配体非依赖性（强直）信号传导，导致过早分化和功能耗竭。因此，需要为γδ T细胞量身定制工程策略。
新型CAR结构：嵌合共刺激结构域受体（CCR）仅包含共刺激基序（如DAP10）而无CD3ζ激活结构域，可与内源性γδ TCR形成布尔逻辑门，在消除强直信号的同时保留抗肿瘤活性。非信号传导CAR（去除CD3ζ）则能通过共定位作用引导γδ T细胞对靶细胞的固有杀伤。
细胞因子装甲：让γδ T细胞分泌细胞因子（称为装甲CAR或TRUCK）可增强其持久性和功能。例如，共同表达IL-15可增强CAR γδ T细胞的扩增和抗肿瘤功效。对前体IL-18进行工程化改造，使其仅在被激活的γδ T细胞中由颗粒酶B切割激活，可显著增强Vδ2细胞的抗肿瘤活性，并上调线粒体质量和相关代谢转运蛋白。
调理素分泌型γδ T细胞：这是一种替代策略，工程化细胞分泌肿瘤特异性的单链抗体-Fc融合蛋白，作为肿瘤细胞与γδ T细胞（以及其他表达Fc的旁观者细胞）之间的桥梁，从而募集更广泛的免疫攻击。
优势负性受体：表达显性负性TGF-β受体II（dnTGFβRII）可使CAR γδ T细胞抵抗肿瘤微环境中TGF-β的免疫抑制作用，改善其细胞毒性和持久性。
细胞内在免疫检查点阻断：设计分泌抗PD-1单链抗体的CAR γδ T细胞，可局部中和抑制性免疫信号，从而增强肿瘤浸润和疾病控制。
CAR替代方案：T细胞受体融合构建体（TruC）将合成抗原识别结构域直接融合到CD3ε上，使其能整合到TCR/CD3复合物中，从而同时利用γδ T细胞的先天和适应性免疫功能。
化疗耐药性Vδ2细胞：通过使Vδ2细胞过表达O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT），可赋予其对替莫唑胺的耐药性，从而允许与这种可上调NKG2D配体的化疗药物联合使用，治疗如胶质母细胞瘤等肿瘤。
工程化γδ T细胞疗法的临床经验
迄今为止，基因修饰γδ T细胞疗法的临床经验仍处于早期阶段，大多数已注册的研究是I期试验，且多采用同种异体方法，这凸显了其GvHD风险极低的优势。
早期数据显示了良好的安全性和有希望的疗效信号。例如，Adicet Bio的CD20 CAR Vδ1细胞疗法（ADI-001）在B细胞恶性肿瘤患者中，6名治疗患者中有4名达到完全缓解，且未观察到GvHD或剂量限制性毒性。然而，反应持久性不足，该肿瘤学项目已中止。IN8Bio的MGMT工程化Vδ2细胞治疗胶质母细胞瘤的I期试验建立了良好的安全性，但II期研究已终止，突显了治疗此类实体瘤的挑战。针对B7-H3的CAR γδ T细胞通过鞘内给药治疗复发性胶质母细胞瘤等疾病，已显示出初步疗效迹象，但反应持久性尚不明确。
未来方向与待解决问题
在实现工程化γδ T细胞的全部治疗潜力之前，仍需解决若干挑战。需要更深入地理解γδ T细胞亚群间的生物学差异，以确定针对特定疾病的有效策略。Vδ2细胞主要用于循环系统，可能最适合治疗血液恶性肿瘤；而非δ2细胞（主要是Vδ1）的组织定居性可能使其更适用于治疗实体瘤。包含多种亚型的混合产品也可能是更好的选择。
制造工艺必须在符合GMP法规的前提下设计，并最大限度地利用自动化、封闭式处理、可扩展性和数字数据存储。CAR设计需要进一步优化，以更好地与γδ T细胞底盘兼容，避免耗竭并利用其独特功能（如先天应激感应和ADCC）。增强持久性、减少耗竭仍是关键挑战，细胞因子装甲、检查点阻断等组合策略值得探索。此外，同种异体细胞的宿主排斥问题也需要通过“否决”系统（如靶向CD70的CAR）等策略来应对。
结论
基因工程化的γδ T细胞代表了一项有前途的进展，有潜力为多种肿瘤类型提供可扩展的同种异体“即用型”疗法。这些细胞的安全性非常好，与αβ T细胞相比，细胞因子释放引起的毒性更低。几乎没有临床证据表明γδ T细胞会引起GvHD，因此无需对工程化αβ T细胞同种异体应用所需的复杂基因组编辑。早期的临床试验数据有限但充满希望，继续对CAR和非CAR γδ T细胞平台进行临床评估，以确定其持久性、安全性和有效性，对于指导γδ T细胞疗法的未来应用至关重要。
