《Cells》：ER Proteotoxic Stress Drives Mitochondrial Dysfunction in Heat-Stressed Intestinal Epithelial Cells
Shuai Gao,
Xiaocong Zheng,
Yi Jiang,
Feifan Zhang,
Wengang Pei,
Guang Yang and
Guangliang Liu
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本研究通过整合转录组、代谢组及功能验证，首次在猪肠上皮细胞（IPEC-J2）中系统阐明急性热应激如何通过激活内质网（ER）应激，进而导致线粒体生物能学功能障碍和超微结构损伤。研究揭示了ER应激是连接初始热刺激与下游细胞器损伤的关键中枢机制，为防治家畜热应激性肠道损伤提供了新的潜在治疗靶点。
研究背景与目的
全球气候变化导致热浪频发加剧，对畜牧业构成严重威胁。在热应激条件下，肠道屏障完整性的破坏是其病理发生的关键事件。在细胞层面，内质网（ER）应激和线粒体功能障碍是公认的热应激后果，但ER应激是否以及如何导致肠上皮细胞线粒体功能障碍的直接因果证据仍然有限。本研究旨在利用猪肠上皮细胞（IPEC-J2）模型，通过整合多组学与功能表型分析策略，阐明急性热应激下ER应激与线粒体功能障碍之间的因果联系。
材料与方法
研究使用IPEC-J2细胞系建立体外热应激模型（42°C暴露12小时）。通过CCK-8检测细胞活力，DCFH-DA探针结合流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）。采用RNA测序进行转录组分析，并通过RT-qPCR验证。利用非靶向代谢组学分析代谢物变化。通过蛋白质印迹法检测ER应激标志蛋白（如GRP78、HSP90B1、ATF4、CHOP、p-eIF2α/eIF2α等）及凋亡标志蛋白Cleaved Caspase-3的表达。使用Seahorse XF分析仪评估线粒体呼吸功能，包括基础呼吸、最大呼吸、ATP产生和备用呼吸能力。通过透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构。为验证因果机制，使用ER应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）进行干预，并使用ER应激诱导剂衣霉素（Tunicamycin）进行反向验证。各项检测均设置严格的对照并进行多次生物学重复，数据采用适当的统计学方法进行分析。
结果
1. 热应激诱导时间依赖性ROS积累并损害细胞活力
热应激导致IPEC-J2细胞内ROS水平呈时间依赖性增加，细胞活力相应下降。暴露12小时后，细胞活力降至对照组的约69.1%，此状态被选定用于后续研究，以探究细胞功能障碍的早期机制事件。
2. 转录组分析揭示应激反应通路的广泛重编程
转录组分析显示，热应激导致大量基因差异表达，其中包括经典ER应激标志物HSP90B1、EIF2AK3、DDIT3和HSPA5。基因集富集分析表明“内质网中的蛋白质加工”通路被显著激活。KEGG通路富集分析显示，细胞凋亡、MAPK信号通路、p53信号通路等显著富集。蛋白质印迹结果进一步证实，热应激上调了关键ER应激标志蛋白（HSP90B1、GRP78、ATF4、CHOP）及Cleaved Caspase-3的表达，并增加了eIF2α的磷酸化比例，表明未折叠蛋白反应（UPR）的PERK分支被激活。
3. 非靶向代谢组学揭示热应激诱导的代谢重编程
代谢组学分析显示，热应激与对照细胞代谢状态存在明显分离。多种氨基酸代谢、能量代谢（如氧化磷酸化）和胆汁酸谱发生显著改变。同时，热应激导致细胞内脂质过氧化产物丙二醛（MDA）水平升高，超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，ATP水平显著下降，而乳酸积累增加，表明细胞能量代谢受损并向糖酵解偏移。
4. 整合分析揭示氨基酸与谷胱甘肽代谢的协同改变
转录组与代谢组数据的整合分析聚焦于精氨酸和脯氨酸代谢以及谷胱甘肽代谢通路。结果显示L-谷氨酸、L-脯氨酸、亚精胺等代谢物水平下降，相关代谢酶基因表达发生协同性下调（如ALDH4A1、PYCR3），而亚精胺乙酰转移酶SAT1的表达则显著上调，共同指向多胺和氧化还原稳态的破坏。此外，转录组数据鉴定出一簇在热应激下差异表达的、编码与线粒体相关膜（MAMs）或ER-线粒体信号传导相关蛋白的基因，包括显著上调的ERO1A、BCL2L10和RAB38，这为ER应激信号向线粒体的传递提供了潜在的分子连接。
5. 热应激通过ER应激依赖性机制损害线粒体生物能学
Seahorse功能分析表明，热应激显著损害了线粒体功能，表现为最大呼吸、ATP产生、备用呼吸能力和基础呼吸的降低。关键发现是，ER应激抑制剂4-PBA的共处理可显著缓解这些生物能学缺陷，而ER应激诱导剂衣霉素处理则能复现热应激的损害效应。这直接证明ER应激是热应激诱导线粒体功能障碍的关键介导者。
6. 超微结构与药理学验证ER应激介导的线粒体损伤
TEM观察显示，热应激导致线粒体严重肿胀、嵴结构断裂和紊乱。而与4-PBA共处理可显著减轻这种超微结构损伤。对平行实验批次的蛋白质印迹分析证实，4-PBA处理有效降低了热应激诱导的ER应激标志物（GRP78、HSP90B1、CHOP）的上调及eIF2α磷酸化水平的增加，表明其线粒体保护作用与减轻ER应激直接相关。
结论与展望
本研究综合运用多组学与功能验证，系统阐明了急性热应激在肠上皮细胞中引发以ER应激激活为核心的级联反应，并首次在肠上皮细胞模型中确立了ER应激是驱动下游线粒体生物能学障碍和结构损伤的关键因果机制。抑制ER stress可有效缓解线粒体损伤，这为开发靶向ER proteostasis的干预策略以增强肠上皮细胞耐热性和减轻家畜热应激性肠道损伤提供了新的理论依据和潜在治疗方向。未来研究需在体内模型和慢性热应激条件下进行验证，并利用基因工具进一步阐明具体的信号转导分子。
