《Cells》：CRISPR and Beyond: Genome-Editing Strategies in Retinal Stem Cell Research
Ma?gorzata Woronkowicz,
Maya Natasha Thomas,
Sarah Jacqueline Saram,
Amanda-Jayne F. Carr,
Ana Alonso-Carriazo Fernandez,
Zaynab Butt,
Piotr Skopiński and
Conor M. Ramsden
编辑推荐：
本综述系统阐述了基因组编辑（尤其CRISPR-Cas9、碱基编辑、引导编辑）与多能干细胞(iPSCs/ESCs)结合，在视网膜退行性疾病（如AMD、RP、LCA）建模、机制探索与精准治疗开发中的革命性潜力，展望了其向临床转化的挑战与前景。
视网膜：视觉的精密中枢与脆弱地带
视网膜是高度特化的神经组织，负责将光信号转换为神经电信号，是实现视觉的关键。其结构精细，包含十层细胞结构，其中感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）和视网膜色素上皮(RPE)细胞对维持视觉功能至关重要。然而，视网膜退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性(AMD)和多种遗传性视网膜营养不良(IRDs)，是导致全球不可逆性失明的重要原因。这些疾病通常由基因突变引起，导致感光细胞或RPE细胞的功能丧失和死亡。当前的治疗手段有限，多着眼于延缓病程而非根治，因此，探索能够修复根本遗传缺陷的新策略迫在眉睫。
干细胞平台：构建视网膜研究的“活体实验室”
干细胞，凭借其自我更新和多向分化的能力，为视网膜疾病的建模、药物筛选和再生治疗提供了理想平台。在视网膜研究中应用的干细胞主要分为两大类：眼源性干细胞（如视网膜祖细胞、睫状上皮干细胞、穆勒胶质细胞）和非眼源性干细胞。其中，诱导多能干细胞(iPSCs) 和胚胎干细胞(ESCs) 因其强大的多能性而成为核心工具。
iPSCs由成体体细胞（如皮肤成纤维细胞）重编程获得，避免了ESCs涉及的伦理问题，并能提供患者特异性的细胞来源，用于构建个体化疾病模型和开发自体移植疗法。ESC则具有更高的基因组稳定性。这两种细胞都能在体外被定向分化为视网膜色素上皮(RPE)细胞或自组织形成三维的视网膜类器官(ROs)，后者能复现视网膜的层状结构和多种细胞类型，为研究人类视网膜发育和疾病机制提供了前所未有的生理相关模型。
基因组编辑“工具箱”的演进
将干细胞技术与基因组编辑相结合，使得在人类细胞背景中精确模拟或纠正致病突变成为可能。基因组编辑技术经历了从锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs) 到CRISPR-Cas系统的演进。
CRISPR-Cas9系统因其设计简便、高效和成本效益而成为主流工具。其核心是Cas9核酸酶在单向导RNA(sgRNA)引导下，在特定基因组位点产生DNA双链断裂(DSB)。细胞随后通过易错的非同源末端连接(NHEJ)（常导致基因敲除）或精确的同源定向修复(HDR)（需模板，可实现基因校正或敲入）等途径进行修复。
为进一步提升精准度，新一代编辑器应运而生。碱基编辑器(BEs) 能在不产生DSB的情况下直接实现单个碱基的转换，如将C·G碱基对转换为T·A（CBE）或A·T转换为G·C（ABE），非常适合纠正点突变。引导编辑器(PE) 功能更强大，它利用与逆转录酶融合的Cas9切口酶和特殊的pegRNA，理论上可实现所有12种碱基间的自由转换、小片段的插入或缺失，且无需供体DNA模板，脱靶效应更低。
递送这些编辑工具到目标细胞是关键环节。物理方法（如电转）、病毒载体（如AAV、慢病毒）和非病毒载体（如脂质纳米颗粒、细胞穿膜肽）各有利弊。在视网膜应用中，AAV因其对视网膜细胞的高效转导和低免疫原性而备受青睐，但其有限的包装容量促使人们开发分裂AAV系统或使用更小的Cas酶变体（如SaCas9）。
精准编辑：洞见与疗愈视网膜疾病
利用CRISPR等技术编辑iPSCs或ESCs，研究人员已成功构建了多种视网膜疾病的“培养皿中的疾病模型”，并测试了基因校正策略。
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年龄相关性黄斑变性(AMD)：通过编辑ARMS2、HTRA1、CFH、C3等基因，在iPSC-RPE模型中揭示了氧化应激、补体系统异常激活等在AMD发病中的作用。
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视网膜色素变性(RP)：这是由超过100个基因突变引起的遗传性疾病。研究涵盖了X连锁（RPGR、RP2）、常染色体显性（PRPF31、RHO、PRPH2）和常染色体隐性（USH2A、MERTK、EYS）等多种类型。通过CRISPR-Cas9进行基因敲除、HDR介导的校正或利用引导编辑器修正剪接位点突变，成功恢复了模型细胞的功能，如RPE的吞噬功能或类器官中感光细胞的正常形态。
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莱伯氏先天性黑朦(LCA)：针对RPE65、CEP290、CRB1、AIPL1、LCA5等基因，研究证明了基因校正可以挽救纤毛缺陷、恢复光转导相关蛋白（如PDE6）水平以及改善光感受器外节蛋白运输。
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其他疾病：在斯塔加特病(ABCA4)、卵黄状黄斑营养不良(BEST1)、脉络膜缺失症(CHM)、X连锁青少年视网膜劈裂症(RS1)等疾病模型中，基因组编辑同样被用于创建同基因对照、验证致病机制和测试治疗性校正的有效性。
这些研究大部分集中于利用编辑细胞创建“同基因对照”（即遗传背景相同、仅突变位点不同的细胞系），以在高度可控的条件下剖析突变的确切影响，这凸显了干细胞编辑目前主要作为强大建模工具的角色。同时，这些模型也为测试AAV介导的基因增强疗法等治疗策略提供了理想的临床前平台。
描绘发育蓝图与展望未来疗法
除了疾病建模，基因组编辑的干细胞也被用于绘制人类视网膜发育的图谱。通过将荧光报告基因（如EGFP、tdTomato）精准敲入VSX2、NRL、GNAT2、THY1.2等视网膜特异性基因位点，研究人员能够实时追踪并分选视网膜祖细胞、视网膜节细胞(RGCs)、视杆细胞和视锥细胞等在整个分化过程中的动态变化，深化了对人类视网膜发育规律的理解。
展望未来，将基因组编辑技术推向视网膜疾病的临床治疗仍面临多重挑战。这包括：如何实现编辑组件在体内视网膜细胞中的高效、精准且安全的递送；如何在有丝分裂后的视网膜细胞中提高HDR或引导编辑的效率；如何最大限度降低脱靶编辑和旁观者编辑的风险；如何确保编辑后细胞的长期安全性、功能整合并避免免疫排斥。此外，伦理和监管框架也需要同步完善。
尽管如此，前景依然光明。结合自体iPSCs与精准基因组编辑的个性化疗法，理论上能够为遗传性视网膜疾病患者提供“一劳永逸”的根治性解决方案。随着递送技术、编辑器工程化和安全性评估体系的不断进步，我们有理由期待，这些在“培养皿”中孕育的精准工具，终将照亮视网膜疾病患者重见清晰世界的道路。
