《Microplastics》：Microplastic Occurrence in Ethnic Fermented Fish Products of Northeast India
Soibam Ngasotter,
K. A. Martin Xavier,
Midhun M. Nair,
Sandhiya Venkatesh,
Tao Kara,
Rupali Das,
Soibam Khogen Singh,
Sanjenbam Bidyasagar Singh and
George Ninan
编辑推荐：
本文探讨了源自纺织品的合成塑料微纤维对海洋贻贝的健康影响。在为期14天的半慢性暴露实验中，研究人员通过评估溶酶体膜稳定性、过氧化氢酶、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶等关键生物标志物，揭示了即便在环境相关浓度下，微纤维也能显著破坏细胞稳态、抑制抗氧化防御并改变神经生理功能，为评估海洋微塑料污染的生态风险提供了重要数据。
合成塑料微纤维对黑海贻贝的半慢性暴露效应研究
随着塑料制品的广泛应用，微塑料污染已成为全球性的环境与食品安全问题。其中，合成或塑料微纤维，主要来自纺织品的磨损、洗涤以及渔具的老化，是海洋生态系统中最常见的微塑料污染形式之一。尽管已有大量证据表明微塑料存在于多种海洋生物体内，但关于微纤维对特定物种，尤其是对具有重要生态和经济价值的滤食性贝类的毒性效应，认知仍相对匮乏。本研究以海洋贻贝——地中海贻贝为模型生物，首次在黑海区域通过实验研究，系统评估了合成塑料微纤维在半慢性时间尺度下对该物种的亚致死效应。
1. 引言
塑料，特别是尺寸小于5毫米的微塑料，在海洋环境中因其持久性、广泛分布和潜在毒性而受到极大关注。微纤维，主要由聚酯、聚丙烯或尼龙等构成的线状塑料颗粒，是海洋微塑料污染最主要的形式。其来源广泛，包括纺织品整个生命周期的释放，其中衣物洗涤和日常磨损被认为是微纤维进入环境的主要途径。此外，水产养殖和渔业中使用的渔网、绳索的风化和磨损，也是海洋微纤维污染的重要来源。
贻贝，尤其是地中海贻贝，由于其滤食性、对污染物的敏感性、广泛的地理分布、固着生活方式以及易于实验室操作和采样等特点，常被用作毒理学和环境研究的生物指示剂。它们持续暴露于污染物中，且代谢解毒能力较低，使其成为监测污染物和微塑料影响的理想生物。微塑料被贻贝摄入后，可能导致生理机能下降、组织学改变、炎症、免疫反应变化、溶酶体膜稳定性破坏、氧化应激、神经毒性、遗传毒性等一系列负面影响。然而，针对微纤维，特别是源自合成纺织品磨损和洗涤的微纤维，其对贻贝影响的实验研究仍然有限。本研究旨在填补这一知识空白，评估合成微纤维在环境相关及未来可能浓度下，对地中海贻贝细胞和生化生物标志物的影响。
2. 材料与方法
2.1. 贻贝采集与实验室驯化
成熟的地中海贻贝于2024年12月从黑海西北部罗马尼亚Mangalia沿海地区采集。采集后立即用采样点海水运回实验室，清除附生生物并清洗。随后，贻贝在实验室流水系统中驯化约2.5个月，水温保持在17±3°C，自然光周期，并每日投喂高密度等鞭金藻。
2.2. 水质参数
实验所用天然海水取自远离已知污染源的区域，储存于大型地下储罐。在实验开始前，对海水的理化参数、营养盐和污染物水平进行了全面检测，以确保海水质量符合环境标准且无污染。
2.3. 塑料微纤维的制备
本研究所用微纤维由新购买的蓝色微纤维清洁布制备而成。该布料由80%聚酯和20%聚酰胺制成。将布料碎片在-80°C冷冻后，用电动研磨机磨成细粉。得到的细粉经300微米尼龙筛过滤，以分离出较大颗粒，再通过180微米尼龙滤网进行真空过滤，最终获得目标尺寸范围为180-300微米的微纤维。为模拟真实环境暴露，本研究特意使用商业纺织品作为微纤维来源，而非工业级原始微塑料，以更好地反映其伴随染料、添加剂等化学物质的复合毒性。
2.4. 实验设计
实验选择了壳长4.4至5.7厘米的健康贻贝个体。经过10天的适应期后，进行了为期14天的暴露实验。实验设置了三个微纤维暴露浓度组和一个对照组：
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CTRL（对照组）：无微纤维暴露。
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MF–T1：8 MFs/L，代表黑海罗马尼亚和土耳其海域水表面报告的平均微塑料水平。
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MF–T2：40 MFs/L，代表土耳其沿海水体柱中的平均微塑料丰度。
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MF–T3：100 MFs/L，代表多瑙河输入等可能导致的未来环境浓度情景。
实验期间，每日更换海水并重新添加相应浓度的微纤维悬浮液，以维持恒定的暴露浓度。水质参数（温度、盐度、溶解氧、pH）每日监测。
2.5. 溶酶体膜稳定性测定
暴露结束后，采集所有贻贝的血淋巴，通过中性红滞留时间测定法评估血细胞溶酶体膜稳定性。该方法通过测定中性红染料在溶酶体内的滞留时间来量化膜稳定性，滞留时间缩短表明溶酶体膜稳定性下降，是早期细胞应激的敏感指标。计算出的溶酶体膜稳定性百分比用于量化总体损伤程度。
2.6. 生化生物标志物测定
暴露结束后，对部分贻贝进行解剖，取鳃和消化腺组织。组织经匀浆、离心后，取上清液测定以下三种关键酶的活性：
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过氧化氢酶：通过测量其在固定时间内分解过氧化氢的能力来评估，是关键的抗氧化酶。
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谷胱甘肽S-转移酶：通过测量其催化1-氯-2,4-二硝基苯与还原型谷胱甘肽的结合速率来评估，是II相解毒过程中的关键酶。
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乙酰胆碱酯酶：通过测量其水解乙酰硫代胆碱碘化物的速率来评估，是重要的神经递质水解酶，其活性变化可指示神经毒性。
所有酶活性均通过Bradford法测定的总蛋白含量进行标准化。
2.7. 质量控制与数据分析
为最小化空气中微纤维的污染，所有操作均使用玻璃或金属器皿，实验人员穿着特定服装。使用统计软件对数据进行正态性和方差齐性检验。根据数据特征，采用参数检验（单因素方差分析）或非参数检验（Kruskal-Wallis H检验）比较组间差异，并利用主成分分析探究不同暴露条件下生物标志物数据的整体变异模式。
3. 结果
3.1. 微纤维表征
制备的微纤维在光学显微镜下呈蓝色，形态为长而窄的条带，长度分布不均。尽管目标尺寸为180-300微米，但由于纤维的柔韧性，部分纤维长度超过了300微米。测量结果显示，微纤维的平均长度为743.24±375.67微米，其中长度在400-900微米范围内的纤维占总数的约63.3%。
3.2. 海水质量参数
实验期间，对照组和各暴露组的海水质量参数（温度、盐度、pH、溶解氧）均无显著差异，表明观察到的生物效应可归因于微纤维暴露本身，而非水质波动。
3.3. 微纤维对血细胞溶酶体膜稳定性的影响
溶酶体膜稳定性在所有微纤维暴露组中均受到显著破坏。中性红滞留时间在对照组中最高，在暴露组中则随暴露浓度升高而显著缩短。具体而言，与对照组相比，8、40和100 MFs/L暴露组的中性红滞留时间均显著降低。计算得出的溶酶体膜稳定性百分比也显示，所有暴露组的溶酶体膜损伤程度均显著高于对照组，其中100 MFs/L组损伤最为严重。中性红滞留时间频率分布图进一步显示，对照组个体染料滞留时间多集中在60-120分钟，而暴露组个体则明显向更短时间偏移，部分个体甚至记录到0分钟滞留。根据已有标准，本研究中所有暴露组的中性红滞留时间值均已低于50分钟，表明贻贝处于严重应激状态。
3.4. 微纤维对氧化应激和神经毒性生物标志物的影响
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过氧化氢酶活性：在消化腺中，CAT活性受到显著抑制。与对照组相比，8、40和100 MFs/L暴露组的CAT活性分别降低了31.2%、53.3%和62.1%。统计检验证实，中、高浓度暴露组的CAT活性显著低于对照组和低浓度组。
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谷胱甘肽S-转移酶活性：在消化腺中，GST活性变化模式复杂。在8和100 MFs/L浓度下分别被抑制了19.2%和14.5%，但在40 MFs/L浓度下反而被刺激升高了20.2%。然而，组间差异未达到统计学显著性。
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乙酰胆碱酯酶活性：在鳃组织中，AChE活性表现出浓度依赖性变化。在8 MFs/L浓度下，AChE活性降低了12.8%；而在40和100 MFs/L浓度下，活性则升高了37.5%。统计结果显示，低浓度组与中、高浓度组之间存在显著差异，但与对照组相比，各暴露组均无显著差异。
3.5. 主成分分析
对生物标志物数据进行主成分分析，结果显示前两个主成分可以解释总变异的69.4%。分析图清晰地区分了对照组与中、高浓度微纤维暴露组。中性红滞留时间和过氧化氢酶活性在第一主成分上具有较高的正向载荷，而谷胱甘肽S-转移酶活性则在第二主成分上具有较高的负载荷。这反映了微纤维暴露对溶酶体稳定性和抗氧化防御的抑制效应，以及对神经生理功能的刺激效应。
4. 讨论
本研究证实，即使是在环境相关浓度下，14天的合成塑料微纤维半慢性暴露也能对地中海贻贝造成多方面的亚致死效应。使用商业纺织品制备的微纤维，更真实地模拟了环境中微纤维的复杂化学组成，其伴随的染料和添加剂可能与微纤维本身产生协同毒性效应。
溶酶体膜稳定性的显著破坏是微纤维暴露引起早期细胞应激的明确证据。溶酶体在细胞废物清除和免疫防御中起着核心作用，其膜功能受损会引发一系列下游细胞功能障碍，被认为是预示生长和繁殖受损的预测指标。本研究中所有暴露组贻贝的中性红滞留时间均已降至病理应激阈值以下，凸显了微纤维污染的潜在危害。
过氧化氢酶活性的显著抑制表明，微纤维暴露扰乱了贻贝的抗氧化防御系统。CAT是分解过氧化氢的关键酶，其活性下降可能导致活性氧累积，进而引发氧化损伤。这种抑制可能源于酶的直接氧化失活、能量代谢紊乱导致的合成减少，或组织物理磨损。谷胱甘肽S-转移酶活性的无显著变化，可能意味着在本实验暴露条件下，氧化应激水平尚未达到强烈激活此II相解毒途径的阈值，或者其他抗氧化途径（如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）发挥了主要的补偿作用。
乙酰胆碱酯酶活性的变化模式较为特殊，低浓度抑制而中高浓度刺激。这种刺激效应可能与氧化应激和炎症反应有关。在应激状态下，神经末梢可能释放过量的乙酰胆碱，作为一种神经免疫调节反应。乙酰胆碱酯酶活性的上调，可能是机体为防止胆碱能信号通路过度兴奋而做出的代偿性生理反应，而非传统意义上的神经毒性抑制。这反映了微纤维暴露对神经生理功能的复杂影响。
5. 结论
综上所述，本研究表明，合成塑料微纤维的半慢性暴露可对地中海贻贝的细胞完整性、抗氧化防御和神经生理功能产生显著影响。这些效应在40和100 MFs/L浓度下最为明显，但即使在环境相关水平的8 MFs/L浓度下也能观察到。溶酶体膜稳定性的破坏和过氧化氢酶活性的抑制，明确指出了微纤维引起的氧化和溶酶体应激。乙酰胆碱酯酶活性的改变则揭示了其对神经生理功能的潜在干扰。
这些发现强调了合成微纤维作为一种普遍存在的海洋污染物，即使在相对较低的浓度下，也可能对关键海洋底栖生物产生亚致死效应，进而可能影响种群健康和海洋生态系统的稳定。未来的研究应关注微纤维的长期暴露效应、不同尺寸微纤维的毒性差异、更广泛的生物标志物响应，以及食物可得性对微纤维摄取和毒性的影响，以更全面地评估其生态风险。
